去未結(jié)合到瓣膜上的納米粒，共3次，每次5分鐘，最終制得可控釋VEGF165的PCL納米粒修飾的復(fù)合瓣膜。
[0251]用實(shí)施例一相同的方法對本實(shí)施例制備得到的可控釋放VEGF165的PCL納米材料進(jìn)行粒徑分布表征可得，可控釋放VEGF165的PCL納米材料的平均粒徑為lOOnm。
[0252]用實(shí)施例一相同的方法對本實(shí)施例制備得到的可控釋放VEGF165的PCL納米材料的包封率為83%。
[0253]用實(shí)施例一相同的對本實(shí)施例制備得到的可控釋放VEGF165的PCL納米材料進(jìn)行體外釋放的表征可得，在大約I周內(nèi)，納米材料對VEGF165的釋放速度較緩慢，未見明顯的突釋效應(yīng)。在48h后，釋放率可達(dá)50%。
[0254]實(shí)施例四
[0255]制備一種可控釋放血管內(nèi)皮生長因子的去細(xì)胞瓣膜，步驟如下:
[0256]1.合成馬來酰亞胺-聚乙二醇-聚己內(nèi)酯(MAL-PEG-PCL)，步驟如下:
[0257]MAL-PEG-PCL的合成路線見圖1。采用開環(huán)聚合法，分別稱取經(jīng)干燥處理的5gMAL-PEG和2ml ε -CL置于干燥的25ml三口圓底燒瓶中，加入20微升辛酸亞錫，溶于1ml甲苯中，反復(fù)抽真空充氮?dú)?次后，使上述反應(yīng)物在氮?dú)猸h(huán)境中，于70°C油浴加熱磁力攪拌下，發(fā)生開環(huán)聚合反應(yīng)，經(jīng)72小時(shí)反應(yīng)后，關(guān)閉油浴鍋電源，待反應(yīng)系統(tǒng)冷卻至室溫關(guān)閉氮?dú)?，得到MAL-PEG-PCL粗產(chǎn)物。將所述粗產(chǎn)物在68°C條件下減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)2小時(shí)以除去產(chǎn)物中剩余的甲苯，冷卻至室溫后，加入2ml 二氯甲烷使反應(yīng)產(chǎn)物完全溶解，之后加入40ml乙醚，在4°C下靜置，使產(chǎn)物沉淀，之后在減壓條件下抽濾，得白色沉淀物。反復(fù)上述操作:將其再次溶于二氯甲烷，加入乙醚對其進(jìn)行沉淀，4°C靜置，減壓條件下抽濾，得到白色產(chǎn)物，于-20°C保存，備用。
[0258]2.制備VEGF165-磷脂復(fù)合物，步驟如下:
[0259]稱取大豆磷脂于干燥的西林瓶中，加入叔丁醇，配制成10mg/ml的磷脂/叔丁醇溶液，充分吹打混勻，使磷脂完全溶解。將VEGF165溶于三蒸水中，使VEGF165濃度為10 μ g/ml ο最后將Iml磷脂/叔丁醇溶液與Iml VEGF165水溶液混合，充分吹打混勻，在冷凍干燥機(jī)-60°C條件下預(yù)凍3小時(shí)，再經(jīng)真空干燥20小時(shí)，封口密封于_20°C保存。
[0260]3.制備可控釋放VEGF165的PCL納米材料，步驟如下:
[0261]采用乳化溶劑揮發(fā)法制備經(jīng)MAL-PEG-PCL修飾的載VEGF165-磷脂復(fù)合物的PCL納米材料。首先按下述步驟制備Ο/W型乳劑:取1mg上述凍干的VEGF165-磷脂復(fù)合物、40mg PCLUOmg MAL-PEG_PCL、2ml 二氯甲烷混合，配制成溶液，作為油相，取12ml 2% (w/v)的聚乙烯醇(PVA)水溶液作為水相，將油相加入水相后立即超聲處理，超聲功率為30W，時(shí)間Imin (開5s，關(guān)5s)。然后于常溫下，在700rpm轉(zhuǎn)速下磁力攪拌4.5小時(shí)以揮去二氯甲烷，滴加30微升lwt%的Triton X-100溶液，再在相同轉(zhuǎn)速下攪拌30分鐘以破壞未被載入PCL納米粒的磷脂膠團(tuán)，最終制得納米?；鞈乙?。
[0262]4.按照實(shí)施例一相同的步驟制得巰基化的去細(xì)胞瓣。
[0263]5.制備可控VEGF165的PCL納米粒修飾的復(fù)合瓣膜，步驟如下:
[0264]將巰基化的去細(xì)胞瓣浸沒于稀釋2倍的經(jīng)MAL-PEG-PCL修飾的載VEGF165-磷脂復(fù)合物的PCL納米?；鞈乙褐?，在35°C、75rpm恒溫振蕩器上持續(xù)振蕩8小時(shí)，反應(yīng)在避光條件下進(jìn)行，之后用磷酸鹽緩沖液洗去未結(jié)合到瓣膜上的納米粒，共3次，每次5分鐘，最終制得可控釋VEGF165的PCL納米粒修飾的復(fù)合瓣膜。
[0265]用實(shí)施例一相同的方法對本實(shí)施例制備得到的可控釋放VEGF165的PCL納米材料進(jìn)行粒徑分布表征可得，可控釋放VEGF165的PCL納米材料的平均粒徑為220nm。
[0266]用實(shí)施例一相同的方法對本實(shí)施例制備得到的可控釋放VEGF165的PCL納米材料的包封率為85%。
[0267]用實(shí)施例一相同的對本實(shí)施例制備得到的可控釋放VEGF165的PCL納米材料進(jìn)行體外釋放的表征可得，在大約I周內(nèi)，納米材料對VEGF165的釋放速度較緩慢，未見明顯的突釋效應(yīng)。在48h后，釋放率可達(dá)51%。
[0268]對比例載香豆素-6的PCL納米粒修飾的復(fù)合瓣膜的制備和表征
[0269]為了從不同的角度驗(yàn)證本發(fā)明制備方法的可行性，應(yīng)用熒光分子香豆素-6代替VEGF165-磷脂復(fù)合物，以同樣的方法制備載香豆素-6的經(jīng)MAL-PEG-PCL修飾的PCL納米粒，并通過MAL-PEG-PCL末端馬來酰亞胺中不飽和的碳碳雙鍵與巰基化的去細(xì)胞瓣發(fā)生邁克爾加成反應(yīng)，從而將納米粒連接到去細(xì)胞瓣上。最后通過熒光顯微鏡觀察納米粒是否連接到去細(xì)胞瓣上。
[0270]熒光分子香豆素-6，幾乎不溶于水，親油性強(qiáng)，可代替VEGF165-磷脂復(fù)合物，以從光學(xué)角度證實(shí)本方法的可行性。
[0271 ] 為了證實(shí)納米粒是通過MAL-PEG末端馬來酰亞胺中不飽和的碳碳雙鍵與去細(xì)胞瓣上的巰基發(fā)生邁克爾加成反應(yīng)，而連接到去細(xì)胞瓣上，特設(shè)置對照組:將制備復(fù)合瓣膜的MAL-PEG-PCL換為M-PEG-PCL。M-PEG-PCL上PEG端的基團(tuán)為甲氧基，不是馬來酰亞胺基團(tuán)。甲氧基不具有碳碳雙鍵，不會(huì)與巰基發(fā)生邁克爾加成反應(yīng)。
[0272]1.M-PEG-PCL 的合成
[0273]M-PEG-PCL的合成同實(shí)施例一中MAL-PEG-PCL的合成，將原料MAL-PEG換成M-PEG0
[0274]2.載香豆素-6的PCL納米粒的制備
[0275]采用乳化溶劑揮發(fā)法分別制備經(jīng)MAL-PEG-PCL和M-PEG-PCL修飾的載香豆素_6的PCL納米粒，具體的制備方法同實(shí)施例一中載VEGF165-磷脂復(fù)合物納米粒的制備。
[0276]3.載香豆素-6的納米粒共價(jià)修飾去細(xì)胞瓣膜的制備和表征
[0277]分別將巰基化的去細(xì)胞瓣浸沒于稀釋2倍的經(jīng)MAL-PEG-PCL和M-PEG-PCL修飾的載香豆素-6的PCL納米?；鞈乙褐校嘞戮唧w的方法同實(shí)施例一中復(fù)合瓣膜的制備。制備結(jié)束后分別將2組復(fù)合瓣膜做冰凍切片，甘油緩沖液封片后，于熒光顯微鏡下觀察納米粒共價(jià)修飾去細(xì)胞瓣的情況，以確定納米粒是否成功連接到去細(xì)胞瓣上。
[0278]最終熒光顯微鏡下所見如圖ΙΙ-a和圖ll_b所示。圖中，圖ll-aSSMAL-PEG-PCL修飾的載香豆素-6的復(fù)合瓣膜熒光顯微鏡圖，可見瓣膜表面有非常明亮的綠色熒光，瓣膜內(nèi)部的熒光為非特異性的吸附，圖中，圖ΙΙ-b為無馬來酰亞胺基團(tuán)的M-PEG-PCL修飾的載香豆素-6的復(fù)合瓣膜熒光顯微鏡圖，瓣膜表面未見相對于內(nèi)部更為明顯的熒光。表明經(jīng)MAL-PEG-PCL修飾的納米粒可以通過邁克爾加成反應(yīng)連接到去細(xì)胞瓣，而無馬來酰亞胺基團(tuán)的M-PEG-PCL修飾的納米粒不能連接到去細(xì)胞瓣的表面。
[0279]綜上所述，本發(fā)明通過掃描電子顯微鏡觀察、紅外光譜檢測及熒光分子替代實(shí)驗(yàn)均顯示納米粒子共價(jià)結(jié)合到巰基化的去細(xì)胞瓣膜上，成功制備出具有可控釋放VEGF的新型去細(xì)胞瓣膜。由此可知，本發(fā)明所制備的載血管內(nèi)皮生長因子的納米材料對VEGF165包封率高，粒徑均勻，穩(wěn)定性好。本發(fā)明所制備的可控釋放血管內(nèi)皮生長因子的去細(xì)胞瓣膜，可將外源性生物信號VEGF引入到去細(xì)胞瓣支架材料上，加速去細(xì)胞瓣的內(nèi)皮化，從而改善瓣膜支架材料的生物學(xué)性能，具有廣闊的應(yīng)用前景。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種可控釋放血管內(nèi)皮生長因子的納米材料，其特征在于，所述納米材料采用含有下述組分的原料制成:馬來酰亞胺-聚乙二醇-聚己內(nèi)醋，聚己內(nèi)酯和血管內(nèi)皮生長因子。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的納米材料，其中，所述納米材料采用含有下述組分的原料制成:馬來酰亞胺一聚乙二醇-聚己內(nèi)酯4-10重量份，優(yōu)選為4-6重量份，聚己內(nèi)酯20-40重量份，優(yōu)選為20-30重量份，和血管內(nèi)皮生長因子0.001-0.01重量份，優(yōu)選為0.001-0.005重量份。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的納米材料，其中，所述納米材料采用含有下述組分的原料制成:馬來酰亞胺-聚乙二醇-聚己內(nèi)酯，聚己內(nèi)酯，磷脂和血管內(nèi)皮生長因子。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的納米材料，其中，所述納米材料采用含有下述組分的原料制成:馬來酰亞胺一聚乙二醇-聚己內(nèi)酯4-10重量份，優(yōu)選為4-6重量份，聚己內(nèi)酯20-40重量份，優(yōu)選為20-30重量份，磷脂5-10重量份，優(yōu)選為5-8重量份，和血管內(nèi)皮生長因子0.001-0.01重量份，優(yōu)選為0.001-0.005重量份。5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的納米材料，其中，所述血管內(nèi)皮生長因子包含VEGF165。6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的納米材料，通過包含下述步驟的方法制備得到: 將血管內(nèi)皮生長因子、聚己內(nèi)酯和馬來酰亞胺-聚乙二醇-聚己內(nèi)酯溶于有機(jī)溶劑中形成油相，以水溶性聚合物水溶液為水相，超聲處理得到所述納米材料。7.根據(jù)權(quán)利要求3-5任一項(xiàng)所述的納米材料，通過包含下述步驟的方法制備得到: (1)將所述血管內(nèi)皮生長因子和磷脂混合反應(yīng)得到血管內(nèi)皮生長因子-磷脂復(fù)合物； (2)將血管內(nèi)皮生長因子-磷脂復(fù)合物、聚己內(nèi)酯和馬來酰亞胺-聚乙二醇-聚己內(nèi)酯溶于有機(jī)溶劑中形成油相，以水溶性聚合物水溶液為水相，超聲處理得到所述納米材料。8.根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述的納米材料，其中，所述馬來酰亞胺-聚乙二醇-聚己內(nèi)酯采用包含下述組分的原料制成:馬來酰亞胺-聚乙二醇1-5重量份，優(yōu)選為1-2重量份和ε -己內(nèi)醋0.4-2重量份，優(yōu)選為0.4-1.5重量份。9.根據(jù)權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述的納米材料，其中，所述馬來酰亞胺-聚乙二醇-聚己內(nèi)酯通過包括下述步驟的方法制備得到: (1)將馬來酰亞胺-聚乙二醇、ε-己內(nèi)酯和催化劑混合，在65_70°C溫度下發(fā)生開環(huán)聚合，合成馬來酰亞胺-聚乙二醇-聚己內(nèi)酯初產(chǎn)物； (2)將步驟(I)所述初產(chǎn)物溶解于有機(jī)溶劑中，加入沉淀劑使其沉淀，得到所述馬來酰亞胺-聚乙二醇-聚己內(nèi)酯。10.一種可控釋放血管內(nèi)皮生長因子的去細(xì)胞瓣膜，其特征在于，包括巰基化的去細(xì)胞瓣膜和連接于所述巰基化的去細(xì)胞瓣膜上的權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)所述的納米材料。11.權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)所述納米材料的制備方法，包括下述步驟: 將血管內(nèi)皮生長因子、聚己內(nèi)酯和馬來酰亞胺-聚乙二醇-聚己內(nèi)酯溶于有機(jī)溶劑中形成油相，以水溶性聚合物水溶液為水相，超聲處理得到所述納米材料。12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的制備方法，包括下述步驟: (1)將所述血管內(nèi)皮生長因子和磷脂混合反應(yīng)得到血管內(nèi)皮生長因子-磷脂復(fù)合物； (2)將血管內(nèi)皮生長因子-磷脂復(fù)合物、聚己內(nèi)酯和馬來酰亞胺-聚乙二醇-聚己內(nèi)酯溶于有機(jī)溶劑中形成油相，以水溶性聚合物水溶液為水相，超聲處理得到所述納米材料。13.權(quán)利要求10所述可控釋放血管內(nèi)皮生長因子的去細(xì)胞瓣膜的制備方法，包括下述步驟: (1)去細(xì)胞瓣膜和巰基化試劑N-丁二酸-S-乙?；鶐€基乙二醇酯發(fā)生巰基化反應(yīng)后，用鹽酸羥胺對所生成的乙酰化巰基進(jìn)行保護(hù)，得到巰基化的去細(xì)胞瓣膜； (2)將步驟(I)所述巰基化的去細(xì)胞瓣膜與權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)所述的納米材料混合，反應(yīng)后得到所述可控釋放血管內(nèi)皮生長因子的去細(xì)胞瓣膜。14.權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)納米材料或權(quán)利要求10所述可控釋放血管內(nèi)皮生長因子的去細(xì)胞瓣膜在心臟瓣膜器材中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥和生物材料領(lǐng)域，具體涉及可控釋放血管內(nèi)皮生長因子的去細(xì)胞瓣膜及其制法和應(yīng)用，其包含巰基化的去細(xì)胞瓣膜和連接于所述巰基化的去細(xì)胞瓣膜上的可控釋放血管內(nèi)皮生長因子的納米材料，所述納米材料采用含有下述組分的原料制成：馬來酰亞胺-聚乙二醇-聚己內(nèi)酯，聚己內(nèi)酯和血管內(nèi)皮生長因子；所述血管內(nèi)皮生長因子包括VEGF165。本發(fā)明所述去細(xì)胞瓣膜將外源性生物信號血管內(nèi)皮生長因子引入到去細(xì)胞瓣支架材料上，可加速去細(xì)胞瓣的內(nèi)皮化，從而改善瓣膜支架材料的相關(guān)生物學(xué)性能，具有廣闊的應(yīng)用前景。
【IPC分類】A61K9/51, A61L27/22, A61P9/00, A61L27/18, A61K38/18, A61K47/34
【公開號】CN104958277
【申請?zhí)枴緾N201510178388
【發(fā)明人】周建良, 朱志剛, 聶彬恩, 丁靜麗, 陳佳, 徐建軍, 易應(yīng)萍, 董嘯, 唐燕華, 楊威
【申請人】南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院
【公開日】2015年10月7日
【申請日】2015年4月15日