飾的復(fù)合瓣膜(簡稱載VEGF165組復(fù)合瓣膜)。未載VEGF165的PCL納米粒修飾的復(fù)合瓣膜同樣采取本方法制得(簡稱未載VEGF165組復(fù)合瓣膜)。
[0198]5.2對可控釋放VEGF165的PCL納米粒修飾的復(fù)合瓣膜進行下述表征
[0199]5.2.1掃描電子顯微鏡觀察
[0200]復(fù)合瓣膜經(jīng)2.5%戊二醛4°C固定24小時，系列濃度梯度的乙醇進行脫水，0)2臨界點干燥，離子濺射噴金后，于掃描電子顯微鏡下觀察復(fù)合瓣膜表面納米粒的修飾情況。
[0201]5.2.2紅外光譜表征
[0202]將載VEGF165組復(fù)合瓣膜、未載VEGF165組復(fù)合瓣膜和單純?nèi)ゼ毎昶戒佊诒砻婷髢?nèi)，在冷凍干燥機_56°C條件下預(yù)凍3小時，再經(jīng)真空干燥20小時。制備出各組干燥的瓣膜。以溴化鉀為分散劑，撕取各組干燥的瓣膜于室溫干燥條件下研磨成粉末，取適量各組樣品壓片，于400-4000(^-1掃描，測定其紅外吸收光譜。
[0203]上述表征的結(jié)果如下:
[0204]1.MAL-PEG-PCL 的表征結(jié)果
[0205]紅外光譜如圖2所示，圖2中，A為原料MAL-PEG的紅外光譜，其中1710.31^1?MAL-PEG馬來酰亞胺C = O伸縮振動峰。圖2中，B為合成的MAL-PEG-PCL共聚物的紅外光譜，與圖2-A相比，C = O伸縮振動峰位移至1732.(McnT1，而且強度明顯增大，其原因為合成產(chǎn)物MAL-PEG-PCL中C = O除馬來酰亞胺的C = O外，還增加了 PCL中的C = O。同時，圖2-B 中 1111.65CHT1 處為 MAL-PEG 鏈段 C-0-C 的伸縮振動峰，2800CHT1 ?3000CHT1 處的 C-H伸縮振動峰明顯變寬，主要是因為合成產(chǎn)物MAL-PEG-PCL中PCL部分含有較多的亞甲基。證實合成的共聚物由MAL-PEG鏈段和PCL鏈段組成。
[0206]MAL-PEG-PCL的核磁共振氫譜如圖3所示，MAL-PEG-PCL中PCL段亞甲基的質(zhì)子峰(δ = 1.38、1.65、2.31和4.06ppm)以及MAL-PEG段亞甲基的質(zhì)子峰(主要為δ =3.64ppm)均出現(xiàn)，比較弱的4.23ppm峰與MAL-PEG和PCL連接處的-OCH2CH2O-有關(guān)，6.74ppm峰為馬來酰亞胺乙烯基的質(zhì)子峰，表明合成的產(chǎn)物是MAL-PEG-PCL共聚物。其中PCL鏈段的平均分子量可由PCL鏈段中δ 2.31ppm和MAL-PEG鏈段中δ 3.64ppm處質(zhì)子峰的積分估算，從而估計所合成MAL-PEG-PCL共聚物的平均分子量為5000。
[0207]綜上所述，經(jīng)紅外光譜和核磁共振氫譜確證，用本發(fā)明所述方法合成的共聚物為MAL-PEG-PCL。
[0208]2.可控釋VEGF165的PCL納米材料的表征
[0209]2.1透射電子顯微鏡觀察結(jié)果
[0210]采用透射電子顯微鏡觀察所制備的復(fù)合納米粒，結(jié)果如圖4所示，所制備的納米粒呈球形，表面光滑，形態(tài)規(guī)整，未見明顯的黏附和聚集現(xiàn)象，粒子大小分布均勻，粒徑范圍為 50_100nm。
[0211 ] 2.2粒徑及分布和Zeta電位
[0212]用激光粒度測定儀，濕法進樣，以數(shù)量為基準，測定所制備的復(fù)合納米粒平均粒徑為85.8nm，粒徑多分散指數(shù)PDI為0.06，如圖5所示，Zeta電位為-10.5mV，如圖6所示。
[0213]2.3納米粒的包封率
[0214]以包封VEGF165量占總VEGF165量的百分率計算包封率。VEGF165的含量采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法測定。經(jīng)測定得出所制備復(fù)合納米粒的包封率達82%。
[0215]2.4納米粒的體外釋放
[0216]圖7為復(fù)合納米粒的體外累計釋放曲線，在大約I周的時間內(nèi)，納米粒對VEGF165釋放速度較緩慢，未見明顯的突釋效應(yīng)，達到了緩慢控制釋放的效果，在48h時，釋放率可達 57%。
[0217]2.5CCK-8法檢測復(fù)合納米溶液的細胞毒性:
[0218]載VEGF165組納米粒的相對增值率為112.59±8.73%，細胞毒性級別為O級，未載VEGF165組納米粒的相對增值率為97.44±5.69%，細胞毒性級別為O級。由此證實，本發(fā)明所制備的納米控釋復(fù)合物對細胞無毒性作用。載VEGF165組納米粒，不但沒有細胞毒性，反而可促進細胞的增殖，可能由于所包載VEGF165的釋放，使得培養(yǎng)基中VEGF165的濃度升高，從而促進細胞的增殖。
[0219]2.6納米粒的穩(wěn)定性評價
[0220]納米粒在血液循環(huán)中所處的微環(huán)境十分復(fù)雜，如有大量的血細胞、各種電解質(zhì)等等，其中電解質(zhì)的濃度直接影響納米粒的穩(wěn)定性。納米粒的穩(wěn)定性可通過其在不同電解質(zhì)濃度下的絮凝程度來評價。本發(fā)明采用不同離子強度的硫酸鈉溶液來評價納米系統(tǒng)的穩(wěn)定性，以模仿血液循環(huán)中納米粒所處的電解質(zhì)微環(huán)境。
[0221]圖8為納米粒在不同濃度硫酸鈉溶液中的吸光度，可以看出，納米粒的臨界絮凝點約為0.3mol/L，高于人體血液中的電解質(zhì)濃度(主要成分為0.14mol/L Na+和0.1Omol/L Cl—)，推斷納米粒在血液環(huán)境中可以穩(wěn)定存在。
[0222]3.可控釋VEGF165的PCL納米粒修飾的復(fù)合瓣膜的表征
[0223]3.1掃描電子顯微鏡觀察
[0224]掃描電子顯微鏡觀察復(fù)合瓣膜表面納米粒的修飾情況，如圖9-a和9_b所示。圖9-a為經(jīng)納米粒修飾的復(fù)合瓣膜表面情況，可知，延瓣膜纖維走形方向，纖維表面連接一層納米粒顆粒，排列整齊。圖9-b為正常的去細胞瓣，在掃描電子顯微鏡下僅見瓣膜纖維走形，纖維上未見有附著物。說明納米粒確實連接到去細胞瓣上。
[0225]3.2紅外光譜表征
[0226]圖10為載VEGF165組復(fù)合瓣膜(圖C)、未載VEGF165組復(fù)合瓣膜(圖B)和單純?nèi)ゼ毎?圖A)的紅外吸收光譜圖。從圖中可以看出，三者大部分伸縮振動峰是一致的，但在圖1O-C和圖1O-B中出現(xiàn)1731.15CHT1的峰，推斷為納米粒組成成分中的C = O伸縮振動峰，而在圖1O-A中未出現(xiàn)，說明復(fù)合辧膜表面有接有納米粒的材料，間接說明納米粒連接到了去細胞瓣上。
[0227]實施例二
[0228]制備一種可控釋放血管內(nèi)皮生長因子的去細胞瓣膜，步驟如下:
[0229]1.合成馬來酰亞胺-聚乙二醇-聚己內(nèi)酯(MAL-PEG-PCL)，步驟如下:
[0230]MAL-PEG-PCL的合成路線見圖1。采用開環(huán)聚合法，分別稱取經(jīng)干燥處理的IgMAL-PEG和0.8ml ε -CL置于干燥的25ml三口圓底燒瓶中，加入20微升辛酸亞錫，溶于1ml甲苯中，反復(fù)抽真空充氮氣5次后，使上述反應(yīng)物在氮氣環(huán)境中，于68°C油浴加熱磁力攪拌下，發(fā)生開環(huán)聚合反應(yīng)，經(jīng)72小時反應(yīng)后，關(guān)閉油浴鍋電源，待反應(yīng)系統(tǒng)冷卻至室溫關(guān)閉氮氣，得到MAL-PEG-PCL粗產(chǎn)物。將所述粗產(chǎn)物在68°C條件下減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)2小時以除去產(chǎn)物中剩余的甲苯，冷卻至室溫后，加入2ml 二氯甲烷使反應(yīng)產(chǎn)物完全溶解，之后加入40ml乙醚，在4°C下靜置，使產(chǎn)物沉淀，之后在減壓條件下抽濾，得白色沉淀物。反復(fù)上述操作:將其再次溶于二氯甲烷，加入乙醚對其進行沉淀，4°C靜置，減壓條件下抽濾，得到白色產(chǎn)物，于-20°C保存，備用。
[0231]2.制備VEGF165-磷脂復(fù)合物，步驟如下:
[0232]稱取大豆磷脂于干燥的西林瓶中，加入叔丁醇，配制成6mg/ml的磷脂/叔丁醇溶液，充分吹打混勻，使磷脂完全溶解。將VEGF165溶于三蒸水中，使VEGF165濃度為3 μ g/ml ο最后將Iml磷脂/叔丁醇溶液與Iml VEGF165水溶液混合，充分吹打混勻，在冷凍干燥機-50°C條件下預(yù)凍3小時，再經(jīng)真空干燥20小時，封口密封于_20°C保存。
[0233]3.制備可控釋放VEGF165的PCL納米材料，步驟如下:
[0234]采用乳化溶劑揮發(fā)法制備經(jīng)MAL-PEG-PCL修飾的載VEGF165-磷脂復(fù)合物的PCL納米材料。首先按下述步驟制備Ο/W型乳劑:取6mg上述凍干的VEGF165-磷脂復(fù)合物、25mg PCL、4mg MAL-PEG-PCL、Iml 二氯甲烷混合，配制成溶液，作為油相，取8ml 4% (w/v)的聚乙烯醇(PVA)水溶液作為水相，將油相加入水相后立即超聲處理，超聲功率為50W，時間Imin (開5s，關(guān)5s)。然后于常溫下，在700rpm轉(zhuǎn)速下磁力攪拌4.5小時以揮去二氯甲烷，滴加30微升Iwt %的Triton X-100溶液，再在相同轉(zhuǎn)速下攪拌30分鐘以破壞未被載入PCL納米粒的磷脂膠團，最終制得納米?；鞈乙骸?br>[0235]4.按照實施例一相同的方法制備可控釋放VEGF165的PCL納米材料修飾的復(fù)合瓣膜。
[0236]用實施例一相同的方法對本實施例制備得到的MAL-PEG-PCL進行核磁共振氫譜表征可得，本實施例制備得到的MAL-PEG-PCL的平均分子量為7000。
[0237]用實施例一相同的方法對本實施例制備得到的可控釋放VEGF165的PCL納米材料進行粒徑分布表征可得，可控釋放VEGF165的PCL納米材料的平均粒徑為90nm。
[0238]用實施例一相同的方法對本實施例制備得到的可控釋放VEGF165的PCL納米材料的包封率為76%。
[0239]用實施例一相同的對本實施例制備得到的可控釋放VEGF165的PCL納米材料進行體外釋放的表征可得，在大約I周內(nèi)，納米材料對VEGF165的釋放速度較緩慢，未見明顯的突釋效應(yīng)。在48h后，釋放率可達52%。
[0240]實施例三
[0241]制備一種可控釋放血管內(nèi)皮生長因子的去細胞瓣膜，步驟如下:
[0242]1.合成馬來酰亞胺-聚乙二醇-聚己內(nèi)酯(MAL-PEG-PCL)，步驟如下:
[0243]MAL-PEG-PCL的合成路線見圖1。采用開環(huán)聚合法，分別稱取經(jīng)干燥處理的2gMAL-PEG和1.5ml ε -CL置于干燥的25ml三口圓底燒瓶中，加入20微升辛酸亞錫，溶于1ml甲苯中，反復(fù)抽真空充氮氣5次后，使上述反應(yīng)物在氮氣環(huán)境中，于65°C油浴加熱磁力攪拌下，發(fā)生開環(huán)聚合反應(yīng)，經(jīng)72小時反應(yīng)后，關(guān)閉油浴鍋電源，待反應(yīng)系統(tǒng)冷卻至室溫關(guān)閉氮氣，得到MAL-PEG-PCL粗產(chǎn)物。將所述粗產(chǎn)物在65°C條件下減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)2小時以除去產(chǎn)物中剩余的甲苯，冷卻至室溫后，加入2ml 二氯甲烷使反應(yīng)產(chǎn)物完全溶解，之后加入40ml乙醚，在4°C下靜置，使產(chǎn)物沉淀，之后在減壓條件下抽濾，得白色沉淀物。反復(fù)上述操作:將其再次溶于二氯甲烷，加入乙醚對其進行沉淀，4°C靜置，減壓條件下抽濾，得到白色產(chǎn)物，于-20°C保存，備用。
[0244]2.制備VEGF165-磷脂復(fù)合物，步驟如下:
[0245]稱取大豆磷脂于干燥的西林瓶中，加入叔丁醇，配制成10mg/ml的磷脂/叔丁醇溶液，充分吹打混勻，使磷脂完全溶解。將VEGF165溶于三蒸水中，使VEGF165濃度為5 μ g/ml ο最后將Iml磷脂/叔丁醇溶液與Iml VEGF165水溶液混合，充分吹打混勻，在冷凍干燥機-60°C條件下預(yù)凍3小時，再經(jīng)真空干燥20小時，封口密封于_20°C保存。
[0246]3.制備可控釋放VEGF165的PCL納米材料，步驟如下:
[0247]采用乳化溶劑揮發(fā)法制備經(jīng)MAL-PEG-PCL修飾的載VEGF165-磷脂復(fù)合物的PCL納米材料。首先按下述步驟制備Ο/W型乳劑:取1mg上述凍干的VEGF165-磷脂復(fù)合物、30mg PCL、6mg MAL-PEG-PCL、Iml 二氯甲烷混合，配制成溶液，作為油相，取6ml 2% (w/v)的聚乙烯醇(PVA)水溶液作為水相，將油相加入水相后立即超聲處理，超聲功率為50W，時間2min (開10s，關(guān)1s)。然后于常溫下，在700rpm轉(zhuǎn)速下磁力攪拌4.5小時以揮去二氯甲烷，滴加30微升lwt%的Triton X-100溶液，再在相同轉(zhuǎn)速下攪拌30分鐘以破壞未被載入PCL納米粒的磷脂膠團，最終制得納米粒混懸液。
[0248]4.按照實施例一相同的方法制備巰基化去細胞瓣。
[0249]5.制備可控VEGF165的PCL納米粒修飾的復(fù)合瓣膜，步驟如下:
[0250]將巰基化的去細胞瓣浸沒于稀釋2倍的經(jīng)MAL-PEG-PCL修飾的載VEGF165-磷脂復(fù)合物的PCL納米?；鞈乙褐校?0°C、75rpm恒溫振蕩器上持續(xù)振蕩8小時，反應(yīng)在避光條件下進行，之后用磷酸鹽緩沖液洗