全式金生物技術有限公司；
[0125]磷酸鹽緩沖液，PBS購于北京全式金生物技術有限公司；
[0126]血管內皮生長因子ELISA試劑盒購于武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司；
[0127]青霉素、鏈霉素購于華北制藥股份有限公司；
[0128]頭孢唑林鈉購于山東瑞陽制藥有限公司；
[0129]慶大霉素、兩性霉素B購于河南天方藥業(yè)有限公司；
[0130]脫氧核糖核酸酶和核糖核酸酶購于美國Sigma-Aldrich公司；
[0131]胰蛋白酶購于美國Gibco公司；
[0132]人臍靜脈內皮細胞:購于ATCC ;
[0133]豬心臟:購于江西程明食品有限公司；
[0134]磷鎢酸、溴化鉀、乙二胺四乙酸購于國藥集團化學試劑有限公司；
[0135]甲苯、二氯甲烷、乙醚、硫酸鈉、二甲基亞砜等其他試劑購于西隴化工股份有限公司。
[0136]2.設備信息
[0137]恒溫振蕩器:SHA_BA，常州朗越儀器制造有限公司；
[0138]冷凍干燥機:FD-1A_50，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；
[0139]傅立葉紅外光譜儀:Nicolet 5700，美國熱電尼高力公司；
[0140]核磁共振譜儀:AVANCE III 600MHz，瑞士布魯克；
[0141]透射電子顯微鏡:JEM_2100，日本電子株式會社；
[0142]掃描電子顯微鏡:Quanta200F，美國FEI公司；
[0143]焚光顯微鏡:日本奧林巴斯公司；
[0144]電子天平:BSA124S，賽多利斯科學儀器有限公司；
[0145]多功能酶標儀:VAR1SKAN，美國賽默飛世爾科技公司；
[0146]集熱式攪拌器:DF_101S，金壇市科析儀器有限公司；
[0147]數顯恒溫磁力加熱攪拌器:HJ_2A，江蘇金壇晨陽電子儀器廠；
[0148]旋轉蒸發(fā)器:申科R-201，上海申順生物科技有限公司；
[0149]超速離心機:Optima? L-100K Ultracentrifuge,美國貝克曼庫爾特商貿公司；
[0150]激光粒度測定儀及Zeta電位分析儀:PSA NAN02590，英國馬爾文公司；
[0151]CO2細胞培養(yǎng)箱:HERACELL 150i，美國賽默飛世爾科技公司；
[0152]紫外分光光度計:UV-9600，北京北分瑞利分析儀器有限公司；
[0153]超聲波細胞粉碎機:SCIENTZ_ II D，寧波新芝生物科技股份有限公司。
[0154]實施例一
[0155]制備一種可控釋放血管內皮生長因子的去細胞瓣膜，步驟如下:
[0156]1.馬來酰亞胺-聚乙二醇-聚己內酯(MAL-PEG-PCL)的合成和表征
[0157]1.1合成馬來酰亞胺-聚乙二醇-聚己內酯(MAL-PEG-PCL)，步驟如下:
[0158]MAL-PEG-PCL的合成路線見圖1。采用開環(huán)聚合法，分別稱取經干燥處理的IgMAL-PEG和0.4ml ε -CL置于干燥的25ml三口圓底燒瓶中，加入20微升辛酸亞錫，溶于1ml甲苯中，反復抽真空充氮氣5次后，使上述反應物在氮氣環(huán)境中，于68°C油浴加熱磁力攪拌下，發(fā)生開環(huán)聚合反應，經72小時反應后，關閉油浴鍋電源，待反應系統冷卻至室溫關閉氮氣，得到MAL-PEG-PCL粗產物。將所述粗產物在68°C條件下減壓旋轉蒸發(fā)2小時以除去產物中剩余的甲苯，冷卻至室溫后，加入2ml 二氯甲烷使反應產物完全溶解，之后加入40ml乙醚，在4°C下靜置，使產物沉淀，之后在減壓條件下抽濾，得白色沉淀物。重復上述操作:將其再次溶于二氯甲烷，加入乙醚對其進行沉淀，4°C靜置，減壓條件下抽濾，得到白色產物，于-20°C保存，備用。
[0159]1.2對馬來酰亞胺-聚乙二醇-聚己內酯進行下述表征
[0160]1.2.1紅外光譜表征
[0161]以溴化鉀為分散劑，將合成的共聚物于室溫干燥條件下研磨成粉末，將樣品壓片，于400-4000(^-1掃描，測定其紅外吸收光譜。
[0162]1.2.2核磁共振氫譜表征
[0163]將合成的共聚物溶于氘代三氯甲烷中，以四甲基硅烷作為內標物，進行1H-NMR光譜(400MHz)表征。
[0164]2.制備VEGF165-磷脂復合物，步驟如下:
[0165]稱取大豆磷脂于干燥的西林瓶中，加入叔丁醇，配制成5mg/ml的磷脂/叔丁醇溶液，充分吹打混勻，使磷脂完全溶解。將VEGF165溶于三蒸水中，使VEGF165濃度為I μ g/ml ο最后將Iml磷脂/叔丁醇溶液與Iml VEGF165水溶液混合，充分吹打混勻，在冷凍干燥機-56°C條件下預凍3小時，再經真空干燥20小時，封口密封于_20°C保存。
[0166]按照上述VEGF165-磷脂復合物的制備方法制備空白磷脂復合物，區(qū)別僅在于:空白磷脂復合物不含VEGF165。
[0167]3.可控釋放生長因子VEGF165的納米材料的制備和表征
[0168]3.1制備可控釋VEGF165的PCL納米材料，步驟如下:
[0169]復合納米材料的制備路線如圖1所示，采用乳化溶劑揮發(fā)法制備經MAL-PEG-PCL修飾的載VEGF165-磷脂復合物的PCL納米材料。首先按下述步驟制備Ο/W型乳劑:取5mg上述凍干的VEGF165-磷脂復合物、20mg PCL、4mg MAL-PEG-PCL、Iml 二氯甲烷混合，配制成溶液，作為油相，取6ml 2% (w/v)的聚乙烯醇(PVA)水溶液作為水相，將油相加入水相后立即超聲處理，超聲功率為50W，時間Imin (開5s，關5s)。然后于常溫下，在700rpm轉速下磁力攪拌4.5小時以揮去二氯甲烷，滴加30微升Iwt%的Triton X-100溶液，再在相同轉速下攪拌30分鐘以破壞未被載入PCL納米粒的磷脂膠團，最終制得納米?；鞈乙?。
[0170]按照上述相同的乳化溶劑揮發(fā)法制備未載VEGF165的PCL納米粒(未載VEGF165組)，區(qū)別僅在于，用空白磷脂復合物替換所述VEGF165-磷脂復合物。
[0171]3.2對可控釋VEGF165的PCL納米材料進行下述表征
[0172]3.2.1透射電子顯微鏡觀察
[0173]取100微升納米?；鞈乙海♂?00倍的納米?；鞈乙旱渭拥礁灿兄С帜さ你~網上，自然干燥后滴加2%磷鎢酸溶液，染色2分鐘，濾紙吸去多余的液體。自然干燥后將銅網置于透射電子顯微鏡下觀察。
[0174]3.2.2粒徑及分布和Zeta電位
[0175]取4ml納米?；鞈乙河诩す饬６葴y定儀和Zeta電位分析儀上測粒徑和Zeta電位。
[0176]3.2.3納米粒的包封率
[0177]將納米粒溶于二甲基亞砜溶液中，破壞其結構，測定其中總的VEGF165含量(m0)。另外，將納米?；鞈乙航浀蜏爻匐x心(32000rpm，20min，4°C )，取上清液，測定游離VEGF165的含量(Hi1)。以包封VEGF165量占總VEGF165量的百分率計算包封率。VEGF165的含量采用酶聯免疫吸附(ELISA)法，用血管內皮生長因子165(VEGF165)試劑盒測定。
[0178]VEGF165 包封率=(In0-1ii1)/m0 X 100%
[0179]3.2.4納米粒的體外釋放
[0180]取6ml納米?；鞈乙航浀蜏爻匐x心(32000rpm，20min，4°C )后，用5ml磷酸鹽緩沖液于試管中重新分散，封口后放置于37°C恒溫水浴振蕩器中，以75rpm勻速持續(xù)振蕩，分別于6h、12h、24h、2d、3d、5d、7d等時間點將5ml含納米粒的分散液超速離心(32000rpm，20min，4°C )，取盡上清液，再用5ml磷酸鹽緩沖液重新分散納米粒沉淀，封口后再放置于37°C恒溫水浴振蕩器以75rpm勻速持續(xù)振蕩，再于下一時間點將5ml含納米粒的分散液進行超速離心，取盡上清液，直至所有時間點取完，用酶聯免疫吸附(ELISA)法分別測定以上上清液中VEGF165的含量，計算VEGF165的累計釋放百分數。
[0181]3.2.5測定納米材料混懸液的細胞毒性
[0182]為觀察復合納米混懸液是否影響細胞的增殖能力，采用CCK-8法檢測復合納米溶液的細胞毒性，從而評價其作為藥物載體的安全性。步驟如下:
[0183]針對載VEGF165組與未載VEGF165組，各取Iml納米粒混懸液，用5ml磷酸鹽緩沖液稀釋，經孔徑0.22 μ m無菌濾器除菌后備用，單純磷酸鹽緩沖液組為陰性對照。將生長旺盛的人臍靜脈內皮細胞用含10%重量含量的胎牛血清(FBS)的RPMI1640細胞培養(yǎng)液制備成5X 103/ml的細胞懸液備用;參照TransDetect? Cell Counting Kit說明書，在96孔細胞培養(yǎng)板上每孔種植100 μ I上述細胞，每個實驗條件設置6個復孔，將培養(yǎng)板置于37°C、5% CO2體積含量的培養(yǎng)箱內預培養(yǎng)，待12小時后細胞貼壁良好，向培養(yǎng)板相應孔中分別加入10 μ I的載VEGF165組納米粒、未載VEGF165組納米粒和對照組(磷酸鹽緩沖液)；將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱孵育24小時，小心向每孔加入11 μ I CCK-8溶液，再將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內孵育2h后，用酶標儀測定450nm處各孔的吸光度值，計算細胞相對增值率(RGR):
[0184]RGR(% )=實驗組平均吸光度值/對照組平均吸光度值
[0185]3.2.6納米粒的穩(wěn)定性評價
[0186]采用不同離子強度的硫酸鈉溶液來評價納米系統的穩(wěn)定性，以模仿血液循環(huán)中納米粒所處的電解質微環(huán)境。在37°C下，將100 μ I納米粒混懸液(20mg/ml)加入5ml不同濃度的硫酸鈉溶液中，所述硫酸鈉溶液的濃度分別為0.1mol/L、0.2mol/L、0.3mol/L、0.4mol/L、0.5mol/L、0.6mol/L、0.7mol/L、0.8mol/L、0.9mol/L，靜置 10 分鐘后，用紫外分光光度計于560nm分別測定復合納米粒溶液的吸光度，進而評價復合納米粒溶液的穩(wěn)定性。
[0187]4.去細胞瓣的制備及巰基化
[0188](I)獲取豬主動脈瓣，步驟如下:
[0189]清潔條件下獲取豬心臟，4 °C生理鹽水沖洗心臟以去除血污，暴露主動脈根部，剪斷附近的心肌、腱索等并取出含瓣葉的主動脈根部，4°C生理鹽水反復沖洗，置于4°C含抗生素(頭孢唑林鈉lg/L，慶大霉素0.4g/L，兩性霉素B0.5g/L)的生理鹽水中帶回實驗室。在實驗室環(huán)境下裁剪主動脈瓣葉，再給予4°C磷酸鹽緩沖液反復沖洗，置于4°C含抗生素(青霉素(100U/ml)，鏈霉素(100 μ g/ml))的高糖DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)12小時。
[0190](2)制備去細胞瓣，步驟如下:
[0191]參照參考文獻(董念國等，組織工程瓣膜天然支架去細胞方法的比較.中華實驗外科雜志，2005.22 (3):第377頁.)中所述方法制備去細胞瓣，步驟如下:
[0192]將獲取的瓣膜置于37°C含0.05%胰蛋白酶和0.02% EDTA的磷酸鹽緩沖液中12小時，再置于4°C含1% Triton X-100的去細胞液中48小時，磷酸鹽緩沖液沖洗后，置于37°C含核酸酶(脫氧核糖核酸酶200mg/L、核糖核酸酶20mg/L)的磷酸鹽緩沖液處理I小時，最后用磷酸鹽緩沖液清洗，去細胞瓣完成制備。
[0193](3)制備巰基化去細胞瓣，步驟如下:
[0194]將制備好的去細胞瓣與20ml巰基化試劑N- 丁二酸-S-乙?；鶐€基乙二醇酯(2mg/ml，pH 7.4)于37°C下反應2小時，磷酸鹽緩沖液洗脫終止反應后，加入20ml的0.5mol/L鹽酸羥胺進行反應，對乙?；瘞€基進行保護，用磷酸鹽緩沖液洗去殘余鹽酸羥胺，制得巰基化的去細胞瓣。
[0195]5.可控VEGF165的PCL納米粒修飾的復合瓣膜的制備和表征
[0196]5.1制備可控VEGF165的PCL納米粒修飾的復合瓣膜，步驟如下:
[0197]將巰基化的去細胞瓣浸沒于稀釋2倍的經MAL-PEG-PCL修飾的載VEGF165-磷脂復合物的PCL納米?；鞈乙褐?，在37°C、75rpm恒溫振蕩器上持續(xù)振蕩8小時，反應在避光條件下進行，之后用磷酸鹽緩沖液洗去未結合到瓣膜上的納米粒，共3次，每次5分鐘，最終制得可控釋VEGF165的PCL納米粒修