r>[0028] 6、本發(fā)明所述交聯(lián)線粒體靶向阿霉素脂質(zhì)體制備方法操作簡(jiǎn)單，工藝條件溫和， 采用常規(guī)設(shè)備即可實(shí)現(xiàn)。
【附圖說明】
[0029] 圖1是實(shí)施例1制備的可交聯(lián)線粒體靶向聚乙二醇化磷脂藥用材料的質(zhì)譜圖。
[0030] 圖2是實(shí)施例1制備的可交聯(lián)線粒體靶向聚乙二醇化磷脂藥用材料的核磁氫譜 圖。
[0031] 圖3是實(shí)施例1~4制備的可交聯(lián)線粒體靶向聚乙二醇化磷脂藥用材料的細(xì)胞毒 性測(cè)試結(jié)果。
[0032]圖4是實(shí)施例1制備的交聯(lián)線粒體靶向脂質(zhì)體和普通脂質(zhì)體的細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)結(jié)果 圖。
[0033]圖5是實(shí)施例1制備的交聯(lián)線粒體靶向脂質(zhì)體和普通脂質(zhì)體的線粒體攝取實(shí)驗(yàn)結(jié) 果圖。
[0034]圖6為荷瘤小鼠尾靜脈注射實(shí)施例2制備的交聯(lián)線粒體靶向阿霉素脂質(zhì)體后腫瘤 體積變化曲線（**表示P〈〇. 01)。
[0035]圖7為荷瘤小鼠尾靜脈注射實(shí)施例2制備的交聯(lián)線粒體靶向阿霉素脂質(zhì)體后體重 變化曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0036] 下面通過【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明所述交聯(lián)線粒體靶向阿霉素脂質(zhì)體及其制備方 法做進(jìn)一步說明。
[0037] 以下實(shí)施例中，二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-馬來酰 胺（DSPE-PEG2000-Mal)、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-馬來酰 胺（DMPE-PEG2000-Mal)、二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-馬來酰 胺（DPPE-PEG2000-Mal)、二月桂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-馬來酰胺 (DLPE-PEG2000-Mal)購自美國(guó)Nanocs公司。D-(KLAKLAK)2-C5多肽購自中科亞光科技有 限公司。鹽酸阿霉素購自大連美侖生物技術(shù)有限公司。大豆卵磷脂、蛋黃卵磷脂、氫化卵磷 月旨、膽固醇購自西安瑞禧生物科技有限公司。
[0038] 實(shí)施例1
[0039] 本實(shí)施例所述阿霉素脂質(zhì)體由阿霉素、大豆卵磷脂、膽固醇和可交聯(lián)線粒體靶向 聚乙二醇化二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（DSPE-PEG2000-KLA)組成。所述鹽酸阿霉素與大豆卵 磷脂質(zhì)量比為1 :5。大豆卵磷脂、膽固醇和DSPE-PEG2000-KLA的摩爾比為50:47:3,所述 DSPE-PEG2000-KLA的結(jié)構(gòu)式為
[0040]
[0041] 制備方法如下：
[0042] (l)DSPE-PEG2〇0〇-KLA的制備
[0043]以二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-馬來酰亞胺（DSPE-PEG2000-Mal)、多 肽D-(KLAKLAK)2-(：5和三乙胺為原料，多肽D-(KLAKLAK)2_C5、三乙胺、DSPE-PEG2000-Mal的 摩爾比為1:1:1 ;
[0044] 在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，將DSPE-PEG2000-Mal、三乙胺和氯仿混合均勻得到第一溶液，所 述氯仿的用量為使第一溶液中DSPE-PEG2000-Mal的濃度為100mm〇l/L，三乙胺的濃度為 100mmol/L；
[0045] 在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，將多肽D-(KLAKLAK)2_C5溶于甲醇中得到第二溶液，甲醇的用量為 使第二溶液中多肽D-(KLAKLAK)2-C5濃度為100m〇l/L;
[0046] 將第一溶液和第二溶液混合，在避光、20°C條件下攪拌反應(yīng)48小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后 采用減壓旋轉(zhuǎn)干燥法蒸除溶劑，將所得固態(tài)物質(zhì)用氯仿溶解，并用濾紙過濾掉不溶物，收集 濾液，采用減壓旋轉(zhuǎn)干燥法蒸除濾液中的溶劑，即得到DSPE-PEG2000-KLA，其質(zhì)譜圖見圖 1，氫核磁譜圖見圖2。
[0047] (2)交聯(lián)線粒體靶向阿霉素脂質(zhì)體的制備
[0048] 將磷脂、膽固醇和步驟⑴制備的DSPE-PEG2000-KLA溶于二氯甲烷與甲 醇以體積比1:1組合所得的組合溶劑中得到第三溶液，所述大豆卵磷脂、膽固醇與 DSPE-PEG2000-KLA的摩爾比為50:47:3，所述組合溶劑的用量以使所得溶液中磷脂濃度為 8mmol/L為限，減壓蒸餾去除所述組合溶劑后得到脂膜，將所得脂膜與300mmol/L硫酸氨緩 沖液混合并經(jīng)探頭超聲分散均勻得到脂質(zhì)體懸液，所述硫酸氨緩沖液的用量以所得脂質(zhì)體 懸液中磷脂濃度為〇.lmm〇l/L計(jì)，將所得脂質(zhì)體懸液裝入半透膜中，并將半透膜浸入去離 子水中透析4小時(shí)，透析結(jié)束后，將透析后的脂質(zhì)體懸液與lmg/ml阿霉素鹽酸鹽水溶液混 合攪拌1小時(shí)得到混合懸液，其中鹽酸阿霉素與磷脂質(zhì)量比為1 :5。然后在持續(xù)通入氧氣 和攪拌的條件下向所得混合懸液中加入乙二硫醇并反應(yīng)〇. 5小時(shí)，加入的乙二硫醇與混合 懸液中DSPE-PEG2000-KLA的摩爾比為2 :1，再通過凝膠滲透柱分離除去游離藥物和未反應(yīng) 的乙二硫醇，即得到交聯(lián)線粒體靶向阿霉素脂質(zhì)體。
[0049] 實(shí)施例2
[0050] 本實(shí)施例所述阿霉素脂質(zhì)體由阿霉素、蛋黃卵磷脂、膽固醇和線粒體靶向聚乙 二醇化二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺（DMPE-PEG2000-KLA)組成。所述鹽酸阿霉素與蛋黃 卵磷脂質(zhì)量比為1 :20。蛋黃卵磷脂、膽固醇和DMPE-PEG2000-KLA的摩爾比為90:2:8， DMPE-PEG2000-KLA的結(jié)構(gòu)式為
[0051]
[0052] 所述脂質(zhì)體的制備方法如下：
[0053] (1)DMPE-PEG2000-KLA的制備
[0054]以二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-馬來酰亞胺（DMPE-PEG2000_Mal)、 多肽D-(KLAKLAK) 2-(：5和4-二甲氨基吡啶為原料，多肽D-(KLAKLAK) 2-C5、4-二甲氨基吡啶、 DMPE-PEG2000-Mal的摩爾比為 2:2:1 ;
[0055] 在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，將DMPE-PEG2000_Mal、4-二甲氨基吡啶、二氯甲烷混合均勻得到 第一溶液，二氯甲烷的用量為使第一溶液中DMPE-PEG2000-Mal的濃度為200mmol/L，4-二 甲氨基吡啶的濃度為400mmol/L;
[0056] 在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，將多肽D- (KLAKLAK) 2-C5溶于N，N-二甲基甲酰胺中得到第二溶液， N，N-二甲基甲酰胺的用量為使第二溶液中多肽D-(KLAKLAK)2-C5濃度為400mol/L;
[0057] 將第一溶液和第二溶液混合，在避光、40°C條件下攪拌反應(yīng)24小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后 采用減壓旋轉(zhuǎn)干燥法蒸除溶劑，將所得固態(tài)物質(zhì)用二甲亞砜溶解，并用濾紙過濾掉不溶物， 收集濾液，采用減壓旋轉(zhuǎn)干燥法蒸除濾液中的溶劑，即得到DMPE-PEG2000-KLA。
[0058] (2)交聯(lián)線粒體靶向阿霉素脂質(zhì)體的制備
[0059] 將蛋黃卵磷脂、膽固醇和步驟（1)制備的DMPE-PEG2000-KLA溶于二氯甲烷與 甲醇以體積比3:1組合得到的組合溶劑中得到第三溶液，所述蛋黃卵磷脂、膽固醇與 DMPE-PEG2000-KLA的摩爾比為90:2:8，所述組合溶劑用量以使所得溶液中磷脂濃度為 5mmol/L為限，減壓蒸餾去除所述組合溶劑后得到脂膜，將所得脂膜與250mmol/L硫酸氨緩 沖液混合并經(jīng)探頭超聲分散均勻得到脂質(zhì)體懸液，所述硫酸氨緩沖液的用量以所得脂質(zhì)體 懸液中磷脂濃度為lmm〇l/L計(jì)，將所得脂質(zhì)體懸液裝入半透膜中，并將半透膜浸入去離子 水中透析12小時(shí)，透析結(jié)束后，將透析后的脂質(zhì)體懸液與10mg/ml的阿霉素鹽酸鹽水溶液 混合攪拌1小時(shí)得到混合懸液，其中鹽酸阿霉素與磷脂質(zhì)量比為1 :20。然后在持續(xù)通入氧 氣和攪拌的條件下向所得混合懸液中加入乙二硫醇并反應(yīng)24小時(shí)，加入的乙二硫醇與混 合懸液中DMPE-PEG2000-KLA的摩爾比為3 :1，再通過凝膠滲透柱分離除去游離藥物和未反 應(yīng)的乙二硫醇，即得到交聯(lián)線粒體靶向阿霉素脂質(zhì)體。
[0060] 實(shí)施例3
[0061] 本實(shí)施例所述阿霉素脂質(zhì)體由阿霉素、氫化卵磷脂、膽固醇和線粒體靶向聚乙 二醇化二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺（DPPE-PEG2000-KLA)組成。所述鹽酸阿霉素與氫化卵 磷脂質(zhì)量比為1 :1〇。氫化卵磷脂、膽固醇和DPPE-PEG2000-KLA的摩爾比為70:25:5， DPPE-PEG2000-KLA的結(jié)構(gòu)式為
[0062]
[0063] (1)DPPE-PEG2000-KLA的制備
[0064] 以二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-馬來酰亞胺（DPPE-PEG2000_Mal)、多 肽D- (KLAKLAK) 2-(：5和N，N-二異丙基乙胺為原料，多肽D- (KLAKLAK) 2-C