5、N，N-二異丙基乙 胺、DPPE-PEG2000-Mal的摩爾比為 3:3:1 ;
[0065] 在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，將DPPE-PEG2000_Mal、N，N-二異丙基乙胺、二氯甲烷混合均勻得 到第一溶液，所述二氯甲烷的用量為使第一溶液中DPPE-PEG2000-Mal的濃度為300mmol/ L，N，N-二異丙基乙胺的濃度為900mmol/L;
[0066] 在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，將多肽D- (KLAKLAK) 2-C5溶于N，N-二甲基甲酰胺中得到第二溶液， N，N-二甲基甲酰胺的用量為使第二溶液中多肽D-(KLAKLAK)2-C5濃度為900mol/L;
[0067] 將第一溶液和第二溶液混合，在避光、25°C條件下攪拌反應(yīng)12小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后 采用減壓旋轉(zhuǎn)干燥法蒸除溶劑，將所得固態(tài)物質(zhì)用二甲亞砜溶解，并用濾紙過濾掉不溶物， 收集濾液，采用減壓旋轉(zhuǎn)干燥法蒸除濾液中的溶劑，即得到DPPE-PEG2000-KLA。
[0068] (2)交聯(lián)線粒體靶向阿霉素脂質(zhì)體的制備
[0069] 將氫化卵磷脂、膽固醇和步驟（1)制備的DPPE-PEG2000-KLA溶于二氯甲烷中得到 第三溶液，所述氫化卵磷脂、膽固醇與0??￡^^62000-1(1^的摩爾比為70 :25:5，所述二氯甲 烷的用量以使所得溶液中磷脂濃度為lmm〇l/L為限，減壓蒸餾去除二氯甲烷后得到脂膜， 將所得脂膜與350mmol/L硫酸氨緩沖液混合并經(jīng)探頭超聲分散均勻得到脂質(zhì)體懸液，所述 硫酸氨緩沖液的用量以所得脂質(zhì)體懸液中磷脂濃度為10mm〇l/L計(jì)，將所得脂質(zhì)體懸液裝 入半透膜中，并將半透膜浸入去離子水中透析10小時(shí)，透析結(jié)束后，將透析后的脂質(zhì)體懸 液與5mg/ml阿霉素鹽酸鹽水溶液混合攪拌1小時(shí)得到混合懸液，其中鹽酸阿霉素與磷脂質(zhì) 量比為1 :1〇。然后在持續(xù)通入氧氣和攪拌的條件下向所得混合懸液中加入乙二硫醇并反 應(yīng)12小時(shí)，加入的乙二硫醇與混合懸液中DPPE-PEG2000-KLA的摩爾比為4 :1，再通過凝膠 滲透柱分離除去游離藥物和未反應(yīng)的乙二硫醇，即得到交聯(lián)線粒體靶向阿霉素脂質(zhì)體。
[0070] 實(shí)施例4
[0071] 本實(shí)施例所述阿霉素脂質(zhì)體由阿霉素、大豆卵磷脂、膽固醇和線粒體靶向聚乙二 醇化二月桂酰磷脂酰乙醇胺（DLPE-PEG2000-KLA)組成。所述阿霉素與大豆卵磷脂質(zhì)量比 為 1 :15。大豆卵磷脂、膽固醇和DLPE-PEG2000-KLA的摩爾比為 60:35:5,DLPE-PEG2000-KLA 的結(jié)構(gòu)式為
[0072]
[0073] (1)DLPE-PEG2000_KLA的制備
[0074] 以二月桂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-馬來酰亞胺（DLPE-PEG2000_Mal)、多 肽D-(KLAKLAK)2-(：5和三乙胺為原料，多肽D-(KLAKLAK)2_C5、三乙胺、DLPE-PEG2000-Mal的 摩爾比為3:3:1 ;
[0075] 在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，將DLPE-PEG2000_Mal、三乙胺、氯仿混合均勻得到第一溶液，所 述氯仿的用量為使第一溶液中DLPE-PEG2000-Mal的濃度為100mm〇l/L，三乙胺的濃度為 300mmol/L；
[0076] 在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，將多肽D-(KLAKLAK)2_C5溶于甲醇中得到第二溶液，甲醇的用量為 使第二溶液中多肽D-(KLAKLAK)2-C5濃度為100m〇l/L;
[0077] 將第一溶液和第二溶液混合，在避光、20°C條件下攪拌反應(yīng)48小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后 采用減壓旋轉(zhuǎn)干燥法蒸除溶劑，將所得固態(tài)物質(zhì)用氯仿溶解，并用濾紙過濾掉不溶物，收集 濾液，采用減壓旋轉(zhuǎn)干燥法蒸除濾液中的溶劑，即得到DLPE-PEG2000-KLA。
[0078] (2)線粒體靶向交聯(lián)阿霉素脂質(zhì)體的制備
[0079] 將大豆卵磷脂、膽固醇和步驟（1)制備的DLPE-PEG2000-KLA溶于二氯甲烷與 甲醇以體積比2 :1組合所得的組合溶劑中得到第三溶液，所述大豆卵磷脂、膽固醇與 DLPE-PEG2000-KLA的摩爾比為60:35:5，所述組合溶劑用量以使所得溶液中磷脂濃度為 10mm〇l/L為限，減壓蒸餾去除所述組合溶劑后得到脂膜，將所得脂膜與300mmol/L硫酸氨 緩沖液混合并經(jīng)探頭超聲分散均勻得到脂質(zhì)體懸液，所述硫酸氨緩沖液的用量以所得脂質(zhì) 體懸液中磷脂濃度為0. 5mmol/L計(jì)，將所得脂質(zhì)體懸液裝入半透膜中，并將半透膜浸入去 離子水中透析6小時(shí)，透析結(jié)束后，將透析后的脂質(zhì)體懸液與7mg/ml阿霉素鹽酸鹽水溶液 混合攪拌1小時(shí)得到混合懸液，其中鹽酸阿霉素與磷脂質(zhì)量比為1 :15。然后在持續(xù)通入氧 氣和攪拌的條件下向所得混合懸液中加入乙二硫醇并反應(yīng)4小時(shí)，加入的乙二硫醇與混合 懸液中DLPE-PEG2000-KLA的摩爾比為5 :1，再通過凝膠滲透柱分離除去游離藥物和未反應(yīng) 的乙二硫醇，即得到交聯(lián)線粒體靶向阿霉素脂質(zhì)體。
[0080] 實(shí)施例5:可交聯(lián)線粒體靶向聚乙二醇化磷脂藥用材細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)
[0081] 將密度為1X105個(gè)/mL的L929細(xì)胞（購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)）懸液接種于96孔 培養(yǎng)板內(nèi)，每孔接種〇.lmL，并向每孔加入0.lmL完全培養(yǎng)基（DMEM培養(yǎng)基+10 %胎牛血清 +100g/mL鏈霉素），然后置于37°C、5%C02、飽和濕度的細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱中孵育24h。分別將 實(shí)施例1~4所制備的可交聯(lián)線粒體靶向聚乙二醇化磷脂藥用材料用完全培養(yǎng)基稀釋作為 試驗(yàn)組，終濃度分別為〇? 01mg/mL、0. 05mg/mL、0. 30mg/mL、1. 0mg/mL。以完全培養(yǎng)基為陰性 對(duì)照組。各試驗(yàn)組和陰性對(duì)照組均設(shè)平行樣品3個(gè)。將各試驗(yàn)組和陰性對(duì)照組置于37°C、 5%C02、飽和濕度的細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)48h后棄去每孔中的上清液，用PBS 緩沖液（135mMNaCl，2. 7mMKC1，1. 5mMKH2P04,，8mMK2HP04,pH= 7. 4)洗滌 2 次，然后每 孔加入200LPBS緩沖液，再加入20L5mg/mL的MTT溶液（將0? 5gMTT溶于lOOmLPBS緩 沖液中得到），繼續(xù)培養(yǎng)4h，繼后吸盡上清液，加入100L二甲基亞砜（DMS0)，振蕩10min，用 酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定波長(zhǎng)為570nm處的光密度值（0D)，通過與陰性對(duì)照組的0D值比較得到 各試驗(yàn)組的細(xì)胞存活率。
[0082] 細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果見圖3,從圖3中可以看出，實(shí)施例1~4制備的可交聯(lián)線粒體 靶向聚乙二醇化磷脂藥用材料均無明顯細(xì)胞毒性。
[0083] 實(shí)施例6 :阿霉素脂質(zhì)體長(zhǎng)循環(huán)實(shí)驗(yàn)
[0084] 以實(shí)施例1制備的交聯(lián)線粒體靶向阿霉素脂質(zhì)體和普通阿霉素脂質(zhì)體進(jìn)行長(zhǎng)循 環(huán)實(shí)驗(yàn)，所述普通阿霉素脂質(zhì)體的制備方法如下：以等摩爾量膽固醇替換實(shí)施例1中的 DSPE-PEG2000-KLA，按照實(shí)施例1中步驟（2)的方法制備得到普通阿霉素脂質(zhì)體。
[0085] 將12只Wistar大鼠（購(gòu)自四川大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心）隨機(jī)分為兩組，每組分別尾 靜脈注射線粒體靶向阿霉素脂質(zhì)體和普通阿霉素脂質(zhì)體，給藥劑量為5mg/kg。分別于尾靜 脈注射給藥后的5min、30min、lh、2h、4h、8h、12h、24h、48h通過尾靜脈取血。采用高效液相 法檢測(cè)藥物濃度，采用DAS3. 0藥動(dòng)學(xué)軟件計(jì)算藥物生物半衰期（t1/2)。交聯(lián)線粒體靶向阿 霉素脂質(zhì)體的t1/2為20. 9h，普通阿霉素脂質(zhì)體的11/2為0. 8h，可見本發(fā)明所述交聯(lián)線粒體 靶向阿霉素脂質(zhì)體具有長(zhǎng)循環(huán)的特點(diǎn)。
[0086] 實(shí)施例7 :細(xì)胞攝取與線粒體攝取實(shí)驗(yàn)
[0087] 以實(shí)施例1制備的交聯(lián)線粒體靶向阿霉素脂質(zhì)體和普通阿霉素脂質(zhì)體進(jìn)行細(xì)胞 攝取與線粒體攝取實(shí)驗(yàn)，所述普通阿霉素脂質(zhì)體按照實(shí)施例1步驟（2)的方法，不加可交聯(lián) 線粒體靶向聚乙二醇化磷脂藥用材料制得。
[0088] 將耐藥細(xì)胞株MCF-7/D0X細(xì)胞（購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)）以4X105個(gè)/孔的濃度 懸液接種于6孔培養(yǎng)板內(nèi)，培養(yǎng)基體積為2mL。然后置于37°C、5%C02、飽和濕度的細(xì)胞恒 溫培養(yǎng)箱中孵育24h。將實(shí)施例1制備的交聯(lián)線粒體靶向阿霉素脂質(zhì)體用完全培養(yǎng)基稀釋 作為試驗(yàn)組，以普通阿霉素脂質(zhì)體同法稀釋作為對(duì)照組，再以完全培養(yǎng)基為陰性對(duì)照組。各 組均設(shè)平行樣品3個(gè)。將各組置于37°C、5%C02、飽和濕度的細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 小時(shí)。培養(yǎng)時(shí)間屆滿后棄去上清液，接著以〇. 25%胰酶消化細(xì)胞，并用冷的PBS洗滌兩次， 收集細(xì)胞。用流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞攝取率，收集數(shù)為每個(gè)樣品1X104個(gè)細(xì)胞，熒光強(qiáng)度表 示細(xì)