胞攝取量的大小，實驗結(jié)果見圖4。由圖4可見交聯(lián)線粒體靶向脂質(zhì)體在耐藥腫瘤細(xì)胞 中有更強(qiáng)的熒光強(qiáng)度，說明交聯(lián)線粒體靶向脂質(zhì)體能促進(jìn)耐藥腫瘤細(xì)胞對藥物的攝取。
[0089] 將耐藥細(xì)胞株MCF-7/D0X細(xì)胞（購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫）以4X105個/孔的濃度 懸液接種于6孔培養(yǎng)板內(nèi)，培養(yǎng)基體積為2mL。然后置于37°C、5%C02、飽和濕度的細(xì)胞恒 溫培養(yǎng)箱中孵育24h。將實施例1制備的交聯(lián)線粒體靶向阿霉素脂質(zhì)體用完全培養(yǎng)基稀釋 作為試驗組，以普通阿霉素脂質(zhì)體同法稀釋作為對照組，再以完全培養(yǎng)基為陰性對照組。各 組均設(shè)平行樣品3個。將各組置于37°C、5%C02、飽和濕度的細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 小時。培養(yǎng)時間屆滿后棄去上清液，接著以〇. 25%胰酶消化細(xì)胞，并用冷的PBS洗滌兩次， 收集細(xì)胞，提取線粒體，其步驟根據(jù)細(xì)胞線粒體提取試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所，產(chǎn)品 編號C3601)的說明書進(jìn)行操作：將細(xì)胞加入線粒體提取試劑中反應(yīng)15分鐘，用玻璃勻漿器 攪拌，得到懸液用離心力600g離心lOmin，收集上清液，再以離心力llOOOg離心lOmin，沉 淀即為細(xì)胞線粒體。用流式細(xì)胞儀測定線粒體的藥物攝取量，收集數(shù)為每個樣品IX104個 線粒體，熒光強(qiáng)度表示攝取量的大小，實驗結(jié)果見圖5。由圖5可見交聯(lián)線粒體靶向脂質(zhì)體 在耐藥腫瘤細(xì)胞的線粒體中有更強(qiáng)的熒光強(qiáng)度，說明交聯(lián)線粒體靶向脂質(zhì)體能提高耐藥腫 瘤細(xì)胞線粒體對藥物的攝取。
[0090] 實施例8 :腫瘤治療實驗
[0091] 以實施例2制備的交聯(lián)線粒體靶向阿霉素脂質(zhì)體和普通阿霉素脂質(zhì)體進(jìn)行腫瘤 治療實驗，所述普通阿霉素脂質(zhì)體的制備方法如下：以等摩爾量膽固醇替換實施例2中的 DMPE-PEG2000-KLA，按照實施例2中步驟（2)的方法制備得到普通阿霉素脂質(zhì)體。
[0092] 對18只BALB/c裸鼠（購自四川大學(xué)動物實驗中心，體重18~22g)皮下接種人源 阿霉素耐藥乳腺癌細(xì)胞MCF-7/D0X(購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫），接種量為5X106細(xì)胞/只。 皮下接種MCF-7/D0X的一周后，將12只BALB/c小鼠隨機(jī)分為三組，每組6只，分別命名為 第一組、第二組、第三組。對第一組BALB/c裸鼠尾靜脈注射交聯(lián)線粒體靶向阿霉素脂質(zhì)體， 對第二組BALB/c裸鼠尾靜脈注射普通阿霉素脂質(zhì)體，給藥劑量均為5mg/kg、第三組BALB/c 裸鼠尾靜脈注射生理鹽水。每隔3天給藥一次，即分別于第1、4、7、10天給藥，給藥劑量均 為5mg/kg，共計給藥4次。期間每隔一天稱量裸鼠體重，測量腫瘤尺寸。于第25天處死小 鼠。裸鼠腫瘤體積和體重變化曲線分別見圖6、圖7。腫瘤體積=(長X寬2)/2。
[0093] 從圖6、圖7可知，注射本發(fā)明所述交聯(lián)線粒體靶向阿霉素脂質(zhì)體組的治療組腫瘤 體積更小，體重減輕幅度更小，說明本發(fā)明所述交聯(lián)線粒體靶向阿霉素脂質(zhì)體具有更好的 抗腫瘤效果，特別是對耐藥性腫瘤具有更好的治療效果，并具有更高的安全性。
【主權(quán)項】
1. 一種交聯(lián)線粒體靶向阿霉素脂質(zhì)體，其特征在于所述脂質(zhì)體由鹽酸阿霉素、磷脂、膽 固醇和可交聯(lián)線粒體靶向聚乙二醇化磷脂藥用材料組成，所述鹽酸阿霉素與磷脂的質(zhì)量比 為1 : (5~20)，所述磷脂、膽固醇、可交聯(lián)線粒體靶向聚乙二醇化磷脂藥用材料的摩爾比為 (50~90) : (2~47) : (3~8)，所述可交聯(lián)線粒體靶向聚乙二醇化磷脂藥用材料的結(jié)構(gòu)式 為：所述結(jié)構(gòu)式中，η = 10,12,14,16。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述交聯(lián)線粒體靶向阿霉素脂質(zhì)體，其特征在于所述磷脂為大豆卵 磷脂、蛋黃卵磷脂、氫化卵磷脂中的一種。3. 權(quán)利求要1或2所述交聯(lián)線粒體靶向阿霉素脂質(zhì)體的制備方法，其特征在于工藝步 驟如下： (1) 可交聯(lián)線粒體靶向聚乙二醇化磷脂藥用材料的制備 以脂肪酸酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-馬來酰亞胺、多肽D- (KLAKLAK) 2-C5和有機(jī)堿為 原料，多肽D-(KLAKLAk)2-C5、有機(jī)堿、脂肪酸酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-馬來酰亞胺的摩 爾比為（1~3) :(1~3) :1，所述多肽D-(KLAKLAk)2-C5的氨基酸序列為序列表中SEQ ID NO :1所述； 在氮氣保護(hù)下，將脂肪酸酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-馬來酰亞胺、有機(jī)堿和第一溶劑 混合均勻得到第一溶液，所述第一溶劑的用量應(yīng)使第一溶液中脂肪酸酰磷脂酰乙醇胺-聚 乙二醇-馬來酰亞胺的濃度為100~300mmol/L ; 在氮氣保護(hù)下，將多肽D-(KLAKLAK) 2-(：5溶于第二溶劑中得到第二溶液，第二溶劑的用 量應(yīng)使第二溶液中多肽D-(KLAKLAK)2-Cj^濃度為100~900mol/L ; 將第一溶液和第二溶液混合，在避光、攪拌下于20~40°C反應(yīng)12~48小時，反應(yīng)結(jié)束 后除去溶劑得到固態(tài)物質(zhì)，將所得固態(tài)物質(zhì)用氯仿或二甲亞砜溶解后過濾掉不溶物，收集 濾液，除去濾液中的溶劑即得到可交聯(lián)線粒體靶向聚乙二醇化磷脂藥用材料； (2) 交聯(lián)線粒體靶向阿霉素脂質(zhì)體的制備 將磷脂、膽固醇和步驟（1)制備的可交聯(lián)線粒體靶向聚乙二醇化磷脂藥用材料溶于第 三溶劑中得到第三溶液，所述磷脂、膽固醇、可交聯(lián)線粒體靶向聚乙二醇化磷脂藥用材料的 摩爾比為（50~90) : (2~47) : (3~8)，所述第三溶劑用量應(yīng)使所得第三溶液中磷脂濃度 為1~10mm〇l/L，去除第三溶劑得到脂膜，將所得脂膜與濃度為250~350mmol/L的硫酸氨 緩沖液混合并經(jīng)超聲分散均勻得到脂質(zhì)體懸液，所述硫酸氨緩沖液的用量應(yīng)使脂質(zhì)體懸液 中磷脂濃度為〇. 1~10mm〇l/L，將所得脂質(zhì)體懸液裝入半透膜中，將半透膜浸入去離子水 中透析4~12小時，透析結(jié)束后，將透析后的脂質(zhì)體懸液與濃度為1~10mg/mL的阿霉素 鹽酸鹽水溶液混合均勻得到混合懸液，所述阿霉素鹽酸鹽水溶液的用量應(yīng)使所得混合懸液 中鹽酸阿霉素與磷脂的質(zhì)量比為1 : (5~20)，然后在持續(xù)通入氧氣和攪拌的條件下向所得 混合懸液中加入乙二硫醇并反應(yīng)0. 5~24小時，加入的乙二硫醇與混合懸液中可交聯(lián)線粒 體靶向聚乙二醇化磷脂藥用材料的摩爾比為（1~5) :1，反應(yīng)時間屆滿后，將游離藥物和未 反應(yīng)的乙二硫醇去除，即得到交聯(lián)線粒體靶向阿霉素脂質(zhì)體。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述交聯(lián)線粒體靶向阿霉素脂質(zhì)體的制備方法，其特征在于所述脂 肪酸酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-馬來酰亞胺為脂肪酸酰磷脂酰乙醇胺為二硬脂酰磷脂 酰乙醇胺-聚乙二醇2000-馬來酰胺、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-馬來酰 胺、二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-馬來酰胺、二月桂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇 2000-馬來酰胺中的一種。5. 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述交聯(lián)線粒體靶向阿霉素脂質(zhì)體的制備方法，其特征在于步 驟（1)中所述有機(jī)堿為三乙胺、4-二甲氨基吡啶或者N、N-二異丙基乙胺中的任一種。6. 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述交聯(lián)線粒體靶向阿霉素脂質(zhì)體的制備方法，其特征在于步 驟（1)中所述第一溶劑為二氯甲烷或氯仿。7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述交聯(lián)線粒體靶向阿霉素脂質(zhì)體的制備方法，其特征在于步驟 (1)中所述第一溶劑為二氯甲烷或氯仿。8. 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述交聯(lián)線粒體靶向阿霉素脂質(zhì)體的制備方法，其特征在于步 驟（1)中所述第二溶劑為甲醇、N，N-二甲基甲酰胺、二甲亞砜中的一種。9. 根據(jù)權(quán)利要求5所述交聯(lián)線粒體靶向阿霉素脂質(zhì)體的制備方法，其特征在于步驟 (1)中所述第二溶劑為甲醇、N，N-二甲基甲酰胺、二甲亞砜中的一種。10. 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述交聯(lián)線粒體靶向阿霉素脂質(zhì)體的制備方法，步驟（2)中所 述第三溶劑為三氯甲烷，或二氯甲烷與甲醇以體積比（1~3) :1組合得到的組合溶劑。
【專利摘要】本發(fā)明所述交聯(lián)線粒體靶向阿霉素脂質(zhì)體，由鹽酸阿霉素、磷脂、膽固醇和可交聯(lián)線粒體靶向聚乙二醇化磷脂藥用材料組成，所述鹽酸阿霉素與磷脂的質(zhì)量比為1：(5～20)，所述磷脂、膽固醇、可交聯(lián)線粒體靶向聚乙二醇化磷脂藥用材料的摩爾比為(50～90)：(2～47)：(3～8)，所述可交聯(lián)線粒體靶向聚乙二醇化磷脂藥用材料的結(jié)構(gòu)式為所述結(jié)構(gòu)式中，n＝10，12，14，16。本發(fā)明還提供了上述脂質(zhì)體的制備方法。本發(fā)明所述交聯(lián)線粒體靶向阿霉素脂質(zhì)體不僅具有線粒體靶向性，而且腫瘤細(xì)胞攝取量大，安全性高。
【IPC分類】A61K47/34, A61K9/127, A61K31/704, A61P35/00
【公開號】CN105055315
【申請?zhí)枴緾N201510469458
【發(fā)明人】李莉, 顧忠偉, 姜雷, 孫家維
【申請人】四川大學(xué)
【公開日】2015年11月18日
【申請日】2015年8月3日