mL) 中的40°C溶液中。將反應(yīng)混合物在40°C下攪拌過(guò)夜，然后在0°C下冷卻1小時(shí)。將所得沉 淀物過(guò)濾（布氏漏斗）并用400mL乙腈濕磨，得到呈鹽酸鹽形式的化合物12 (37.lg，87 % 產(chǎn)率），純度為約85-90%。將固體溶解在水中，過(guò)濾并凍干，得到呈白色固體狀的呈鹽酸 鹽形式的化合物12(30. 2g，70%產(chǎn)率），根據(jù)HPLC(254nm)的純度>98%。蟲NMR(400mHz; DMS0-d6) :δ；8. 6 (m, 1H), 8. 3 (m, 1H), 8. 2 (m, 1H), 7. 9-8. 0 (m, 5H), 7. 7 (m, 1H), 7. 6 (t, 2H) ，3. 9 (s，2H)，3. 7-3. 8 (m，4H)，3. 7 (d，2H)，3. 1 (m，2H)，2. 7 (m，2H)，1. 7 (m，2H) 〇MSESI(m/z) :MH+424. 2 ;M-468. 2, 261. 1。
[0197] 向化合物12/HC1 (14. 4g)于350mLDCM中的冷卻（0°C)懸浮液中逐滴添加甲基丙 烯酰氯（化合物8 ;15.lmL)和DIEA(27. 3mL)。將反應(yīng)混合物在0°C下攪拌3小時(shí)，然后升 溫至環(huán)境溫度并且用布氏漏斗收集固體。將產(chǎn)物用150mL水洗滌并干燥為淺粉色固體，其 純度為約80-90%。將固體用乙腈（120mL)濕磨1小時(shí)，過(guò)濾，并在加熱至120°C下再次懸 浮在100mLDMS0中以達(dá)到完全溶解。將在冷卻下沉淀的固體過(guò)濾，并用乙腈沖洗并在真空 下干燥。獲得呈淺粉色固體狀的化合物13 (5. 4g;35%產(chǎn)率），根據(jù)HPLC(265nm)的純度為 約 90%。4NMR(400mHz;DMS0-d6) :δ;8· 5 (t，1H)，8. 3 (t，1H)，8. 2 (t，1H)，7. 9-8. 0 (m，3H) ,7. 7 (m, 2H), 7. 6 (t, 2H), 5. 6 (s, 1H), 5. 3 (s, 1H), 3. 9 (s, 2H), 3. 7-3. 8 (m, 4H), 3. 7 (d, 2H), 3. 1 (m，4H)，1. 9 (s，3H)，1. 6 (m，2H)。MSESI(m/z) :MH+492. 4 ;M-329. 2。
[0198]因?yàn)榧谆Ｂ龋ɑ衔?)與化合物12/HC1的偶聯(lián)的產(chǎn)率低，所以獲得化合 物13的代替性、更會(huì)聚途徑，如以下方案中所示：
[0199]
[0200] 向化合物15(3.9g)于無(wú)水DCM(40mL)中的溶液中添加甲基丙烯酰氯（化合 物8 ;4. 4mL)。將反應(yīng)混合物在環(huán)境溫度下攪拌18小時(shí)。添加2N碳酸氫鈉溶液并且用 DCM(3X)萃取混合物。將合并的有機(jī)相經(jīng)硫酸鈉干燥，過(guò)濾并在減壓下濃縮。將產(chǎn)物經(jīng)硅 膠（DCM，然后DCM/Me0H97/3)純化，得到呈白色固體狀的化合物17(2. 7g，50%產(chǎn)率），根據(jù) HPLC(254nm)的純度為約 98%。4NMR(400mHz;DMS0-d6):ppmδ;7· 9 (m, 1H)，6. 8 (m, 1H)，5 .6 (s, 1H), 5. 3 (s, 1H), 3. 1 (m, 2H), 2. 9 (m, 2H), 1. 9 (m, 3H), 1. 5 (t, 2H), 1. 4 (s, 9H) 〇MSESI(m/ z) :MH+243. 1，187. 1，126. 1 ;M-287. 2。
[0201] 在室溫下向化合物17 (10. 5g)于30mLMeOH中的溶液中添加4NHC1/二噁烷溶液 (21. 7mL)，并且將混合物攪拌16小時(shí)。在減壓下濃縮溶液并且用80mL甲苯濕磨固體。在 過(guò)濾（布氏漏斗）后，獲得呈白色固體狀的化合物18(7.5g，96%產(chǎn)率）。蟲NMR(400mHz; DMS0-d6) :ppmδ；8. 2 (m, 1Η), 8. 0 (m, 3H), 6. 3 (br.s), 5. 7 (s, 1H), 5. 3 (s, 1H), 3. 2 (m, 2H), 2. 8(m，2H)，1. 9(s，3H)，1. 7(m，2H) 〇
[0202] 向HATU(11. 9g)和DIEA(5. 2mL)的溶液中添加化合物4(llg)于120mLDMF中的溶 液。在攪拌10分鐘后，添加化合物18 (5. 88g)、DIEA(5. 2mL)和催化量的吩噻嗪于DMF(24mL) 中的溶液。在16小時(shí)后通過(guò)HPLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)，但發(fā)現(xiàn)未經(jīng)歷完全轉(zhuǎn)化，因此添加另外一定量 的HATU(7g)和化合物18 (8. 9g)、DIEA(8. 7mL)于DMF(30mL)中的溶液。將混合物再攪拌16 小時(shí)。在添加DCM(lOOmL)后，將固體過(guò)濾（布氏漏斗）并用乙腈（150mL)濕磨兩次，得到 呈淺粉色固體狀的化合物13(13.78,92%產(chǎn)率），純度為約95%(265_)。 1!1匪1?(40〇111抱； DMS0-d6) :δ；8. 5 (t, 1H), 8. 3 (t, 1H), 8. 2 (t, 1H), 7. 9-8. 0 (m, 3H), 7. 7 (m, 2H), 7. 6 (t, 2H), 5 .6 (s, 1H), 5. 3 (s, 1H), 3. 9 (s, 2H), 3. 7-3. 8 (m, 4H), 3. 7 (d, 2H), 3. 1 (m, 4H), 1. 9 (s, 3H), 1. 6 (m，2H)。MSESI(m/z):MH+492. 4 ;M-329.2。
[0203] MAG-3與微粒的鏈接
[0204] 可通過(guò)至少兩種一般方法將MAG-3螯合基團(tuán)鏈接至微粒：（1)通過(guò)經(jīng)由鏈接子向 所述螯合基團(tuán)添加可聚合基團(tuán)，和通過(guò)聚合形成微粒（例如，在其他可聚合單體存在下）， 或（2)通過(guò)分別地形成微粒，然后在材料已經(jīng)初始聚合后經(jīng)由鏈接子將所述螯合基團(tuán)與所 述微粒偶聯(lián)。這些一般方法的實(shí)例示于下文：
[0205] 方法 1 :
[0209]實(shí)例4 :方法1的實(shí)例[0210] 方法1的實(shí)例示于以下方案中：
[0212] 使用丙烯酸鈉和N-三-羥基-甲基甲基丙烯酰胺單體，使用水/油乳液-懸浮 液-聚合方法來(lái)制備微球。在這種方法中，在50°C下將6. 75g的N，N-亞甲基-雙丙烯酰 胺、25. 18g的N-三-羥基-甲基甲基丙烯酰胺和2. 2g的丙烯酸鈉（97%)添加至250mL 乙酸鹽緩沖液（用58gNaCl、27. 2g乙酸鈉、400mL水和300mL甘油制備，用乙酸調(diào)節(jié)pH至 6. 0)中。用50%乙酸水溶液調(diào)節(jié)水相的pH以維持pH為6. 0。過(guò)濾水相并且添加過(guò)硫酸 銨溶液（0. 34g過(guò)硫酸銨于5mL水中）。通過(guò)在60°C下利用機(jī)械攪拌器在288rpm下將水相 分散在油相中來(lái)形成乳液。添加lmLTEMED(N，N，N'，N'-四亞乙基戊胺）來(lái)催化反應(yīng)。將 乳液攪拌90分鐘。當(dāng)聚合反應(yīng)完成時(shí)，添加去離子水并且將懸浮液在3500rpm下離心5分 鐘。將微球與上清液分離并用去離子水洗滌4次。利用HC1 1N將微球酸化為pH1.5并且 用去離子水洗滌6次。
[0213] 將微球樣品懸浮在0. 9%NaCl水溶液中以用于粒度測(cè)定分析（Ellix軟件）。結(jié) 果顯示，微球的直徑范圍為約27. 26μm至約140. 34μm，其中平均直徑為約73. 71μm。
[0214] 使用與用于分析圖像的計(jì)算機(jī)鏈接的光學(xué)顯微鏡，在微球凍干后評(píng)估所述微球的 形態(tài)。在凍干后的實(shí)例4的微球的顯微鏡結(jié)果示于圖1中。如圖像中所示，在實(shí)例4中形 成的微球是基本上球形的。
[0215] 實(shí)例4的微粒與MAG-3配體的偶聯(lián)
[0216] 將以下兩種程序用于MAG-3配體與實(shí)例4的微粒的接枝或偶聯(lián)。
[0217] 在第一程序中，將干燥微球（250mg)分散在3. 6mLDMF溶劑中。將DIEA(52. 5mg) 和化合物12的鹽酸鹽（98mg)添加至漿液中。將懸浮液放置在冰浴中并且在0°C下向懸浮 液中添加HATU(81mg)，由此懸浮液變成熒光黃色。將懸浮液在0°C下保持1小時(shí)并且在室 溫下保持19小時(shí)。將微球與上清液分離并用去離子水洗滌4次。
[0218] 在第二程序中，將干燥微球（250mg)分散在3. 6mLDMF溶劑中。將DIEA(52. 5mg) 添加至漿液中。將懸浮液置于冰浴中并且在〇°C下向所述懸浮液中添加HATU(81mg)。在 HATU添加后兩分鐘，添加化合物12的鹽酸鹽（98mg)，由此懸浮液變成赭黃色。將懸浮液在 〇°C下保持1小時(shí)并且在室溫下保持19小時(shí)。將微球與上清液分離并用去離子水洗滌4次。
[0219] 使用與用于分析圖像的計(jì)算機(jī)鏈接的光學(xué)顯微鏡，在分散微粒聚集體的聲波處理 之前和之后，評(píng)估來(lái)自每個(gè)程序的微球樣品的形態(tài)。
[0220] 在聲波處理之前的實(shí)例4的第一程序的微球的顯微鏡結(jié)果示于圖2中。在聲波處 理之后的實(shí)例4的第一程序的微球的顯微鏡結(jié)果示于圖3中。如圖像中所示，通過(guò)實(shí)例4 的微球與MAG-3偶聯(lián)形成的微球是基本上球形的。
[0221] 在聲波處理之前的實(shí)例4的第二程序的微球的顯微鏡結(jié)果示于圖4中。在聲波處 理之后的實(shí)例4的第二程序的微球的顯微鏡結(jié)果示于圖5中。如圖像中所示，通過(guò)實(shí)例4 的微球與MAG-3偶聯(lián)形成的微球是基本上球形的。
[0222] 實(shí)例5 :方法1的另一種實(shí)例
[0223] 方法1的另一種實(shí)例為如下：
[0224] 使用丙烯酸鈉單體，使用水/油乳液-懸浮液-聚合方法來(lái)制備微球。在這種方 法中，在40°C下將6. 75g的N，N-亞甲基-雙丙烯酰胺和27g的丙烯酸鈉（97% )添加至 250mL乙酸鹽緩沖液（用58gNaCl、27. 2g乙酸鈉、400mL水和300mL甘油制備，用乙酸調(diào)節(jié) pH至6. 0)中。用50%乙酸水溶液調(diào)節(jié)水相的pH以維持pH為6. 0。過(guò)濾水相并且添加過(guò) 硫酸銨溶液（〇. 34g過(guò)硫酸銨于5mL水中）。通過(guò)在60°C下利用機(jī)械攪拌器在288rpm下將 水相分散在油相中來(lái)形成乳液。添加lmLTEMED(N，Ν，Ν'，Ν' -四亞乙基戊胺）來(lái)催化反應(yīng)。 將乳液攪拌90分鐘。當(dāng)聚合反應(yīng)完成時(shí)，添加鹽水溶液（2. 7%NaCl水溶液）并且將懸浮 液在3500rpm下離心5分鐘。將微球與上清液分離并用鹽水溶液洗滌4次。利用HC1 1N 將微球酸化為pH1. 5并且用鹽水溶液洗滌兩次并用去離子水洗滌6次。
[0225] 將微球樣品懸浮在0.9%NaCl水溶液中以用于粒度測(cè)定分析（Ellix軟件）。結(jié) 果顯示，微球的直徑范圍為約11. 66μm至約68. 24μm，其中平均直徑為約30. 23μm。
[0226] 使用與用于分析圖像的計(jì)算機(jī)鏈接的光學(xué)顯微鏡，在凍干之前和之后評(píng)估所述微 球的形態(tài)。
[0227] 在凍干前的實(shí)例5的微球的顯微鏡結(jié)果示于圖6中。在凍干后的實(shí)例5的微球的 顯微鏡結(jié)果示于圖7中。如圖像中所示，在實(shí)例5中形成的微球是基本上球形的。
[0228]實(shí)例5的微粒與MAG-3配體的偶聯(lián)
[0229] 將下列程序用于MAG-3配體與實(shí)例5的微粒的偶聯(lián)。
[0230] 將干燥微球（250mg)分散在4. 5mLDMF溶劑中。將DIEA(52. 5mg)和化合物12 的鹽酸鹽（98mg)添加至漿液中。將懸浮液放置在冰浴中并且在0°C下向懸浮液中添加 HATU(81mg)，由此懸浮液變成熒光黃色。將懸浮液在0°C下保持1小時(shí)并且在室溫下保持 21小時(shí)。將微球與上清液分離并用去離子水洗滌4次。
[0231] 將相同的一般程序用于MAG-3配體與尺寸為20μπι的羧酸酯官能化聚苯乙烯 微粒樣品（Polybeads%獲自德國(guó)艾泊爾海姆的波利賽斯公司（P〇lysciences，Inc. (Ellelhieim，Germany)))偶聯(lián)。將干燥微球（25mg)分散在2. 7mLDMF溶劑中。將DIEA(5. 2mg)和化合物12的鹽酸鹽（9. 8mg)添加至漿液中。將懸浮液放置在冰浴中并且 在〇°C下向懸浮液中添加HATU(8.lmg)，由此懸浮液變成熒光黃色。將懸浮液在0°C下保持 1小時(shí)并且在室溫下保持19小時(shí)。將微球與上清液分離并用去離子水洗滌4次。
[0232]實(shí)例6 :方法2的實(shí)例
[0233] 方法2的實(shí)例示于以下方案中：
[0235] 使用水/油乳液-懸浮液聚合方法來(lái)制備含有MAG-3螯合基團(tuán)的微球。將化合物 13(1. 08g)溶解在50mL的pH6乙酸鈉緩沖液中。N，N-亞甲基-雙丙烯酰胺（6. 75g)和 N-三-羥基-甲基甲基丙烯酰胺（25. 92g)添加至化合物13的溶液中，并且用另外的緩沖液 將體積調(diào)節(jié)至200mL。將溶液加熱至50°C。過(guò)濾水相并且添加過(guò)硫酸銨水溶液（0. 34g于5mL 水中）。將混合物倒入含有3. 5g表面活性劑（Arlacel)的1L石蠟油中。通過(guò)在60°C下利用 機(jī)械攪拌器在288rpm下將水相分散成油相中來(lái)形成乳液。添加lmLTEMED(Ν，Ν，Ν'，Ν' -四 亞乙基戊胺）來(lái)催化反應(yīng)。將乳液攪拌至少90分鐘，此時(shí)添加去離子水并且將懸浮液在 3500rpm下離心5分鐘。將微球與上清液分離并用去離子水洗滌四次。
[0236] 如通過(guò)在經(jīng)受聚合的單體混合物中使用的化合物13的量所測(cè)定，這些微球含有 約3%的化合物13。
[0237]實(shí)例7 :方法2的另一種實(shí)例
[0238] 方法2的另一種實(shí)例為如下：
[0239] 使用水/油乳液-懸浮液聚合方法來(lái)制備含有MAG-3螯合基團(tuán)的微球。將化合物 13(2. 15g)溶解在50mL的pH6乙酸鈉緩沖液中。N，N-亞甲基-雙丙烯酰胺（6. 75g)和 N-三-羥基-甲基甲基丙烯酰胺（24. 85g)添加至化合物13的溶液中