膠原材料，可以促進(jìn)外周神經(jīng)再生、促進(jìn)受損的外周神經(jīng)功能指數(shù)恢復(fù)、促進(jìn)外 周神經(jīng)橫斷部位電生理恢復(fù)、促進(jìn)外周神經(jīng)受損部位S-100蛋白表達(dá)、促進(jìn)外周神經(jīng)受損 部位髓鞘直徑和/或髓鞘壁厚度增加、促進(jìn)靶器官的恢復(fù)?？梢?jiàn)，該功能材料在未來(lái)臨床外 周神經(jīng)損傷修復(fù)的應(yīng)用具有更為重要的現(xiàn)實(shí)指導(dǎo)意義。
【附圖說(shuō)明】
[0044] 圖1為外周神經(jīng)損傷修復(fù)膠原支架材料的形態(tài)。其中，A為膠原導(dǎo)管交聯(lián)前膠原 膜的形態(tài)；B為膠原纖維的形態(tài)，C為膠原纖維的電鏡圖。
[0045] 圖2為膠原管和膠原纖維。其中，A為膠原管；B為膠原纖維電鏡圖。
[0046] 圖3為SD大鼠的坐骨神經(jīng)橫斷損傷模型。其中，A為手術(shù)剛剛完成時(shí)；B為術(shù)后 12周。
[0047] 圖4為坐骨神經(jīng)功能指數(shù)檢測(cè)結(jié)果。其中，A為大鼠足跡圖；B為坐骨神經(jīng)功 能指數(shù)。B中，*表示與OCFs+VEGF-CBD組相比，在P〈0. 05水平上差異顯著；林表示與 OCFs+VEGF-CBD組相比，在P〈0. 01水平上差異顯著；#表示與空管組相比在P〈0. 05水平上 差異顯著。
[0048] 圖5為電生理學(xué)神經(jīng)傳導(dǎo)速度檢測(cè)結(jié)果。**表示在P〈0. 01水平上差異顯著。
[0049] 圖6為突光金逆行示蹤檢測(cè)結(jié)果。
[0050] 圖7為NF、RECA-1和S-100表達(dá)情況檢測(cè)。其中，A為熒光檢測(cè)結(jié)果圖（NF為神經(jīng) 絲染色結(jié)果，RECA-1為血管染色結(jié)果，Hoechst顯示細(xì)胞核染色，Merge為前三張圖的疊加 合成）；B為S-100的免疫組化圖譜；C為免疫組化圖譜中單位面積上神經(jīng)纖維數(shù)量統(tǒng)計(jì)結(jié) 果（NF染色的陽(yáng)性面積與視野下圖片總面積的比例）；D為免疫組化圖譜中單位面積上血管 數(shù)量統(tǒng)計(jì)結(jié)果（RECA-1染色的陽(yáng)性面積與視野下圖片總面積的比例）。E為S-100染色的 陽(yáng)性面積與視野下圖片總面積的比例。*表示在P〈〇. 05水平上差異顯著；**表示在P〈0. 01 水平上差異顯著。
[0051] 圖8為形態(tài)學(xué)與再生神經(jīng)的髓鞘分析結(jié)果。其中，A為蘇木素-伊紅染色結(jié)果；B 為髓鞘堅(jiān)牢藍(lán)染色結(jié)果；C為透射電鏡觀(guān)察結(jié)果；D為再生神經(jīng)的髓鞘直徑統(tǒng)計(jì)結(jié)果；E為 再生神經(jīng)的髓鞘厚度統(tǒng)計(jì)結(jié)果。*表示在P〈〇. 05水平上差異顯著；**表示在P〈0. 01水平 上差異顯著。
[0052] 圖9為腓腸肌恢復(fù)率和馬松三色染色結(jié)果。其中，A為馬松三色染色結(jié)果；B為腓 腸肌恢復(fù)率統(tǒng)計(jì)結(jié)果；C為肌肉陽(yáng)性面積比。B和C中，*表示在P〈0. 05水平上差異顯著； **表示在P〈〇. 01水平上差異顯著。
【具體實(shí)施方式】
[0053] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0054] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0055] 實(shí)施例1、用于修復(fù)外周神經(jīng)損傷的膠原支架的制備
[0056] 一、有序膠原材料的制備
[0057] 由本實(shí)驗(yàn)室制備，方法如參考專(zhuān)利ZL 200510098731. 5,具體步驟如下：
[0058] (一）取材與處理
[0059] 1、預(yù)處理筋膜
[0060] 取新鮮帶有白色筋膜的成年牛肌肉，用冷的去離子水沖洗3遍；用鑷子和手術(shù)刀 分離出筋膜，盡量去除內(nèi)層粘附的肌肉組織，和外層的脂肪等組織。
[0061] 2、材料制備
[0062] 將步驟1獲得的預(yù)處理筋膜按如下步驟處理：
[0063] 1)置于1 % (體積百分比）TnBP(磷酸三丁酯）溶液（50mM Tris-HCl緩沖液， pH8. 0)中處理48小時(shí)；
[0064] 2)50mM Tris-HCl 緩沖液（pH8. 0,含有 1M NaCl)中處理 48 小時(shí)；
[0065] 3) lg(2. 5X 105U)胰蛋白酶 /100ml (50mM Tris-HCl 緩沖液，pH8. 0)中處理 72 小 時(shí)；其中，胰蛋白酶為Amresco公司產(chǎn)品，其產(chǎn)品目錄號(hào)為9002-07-7。
[0066] 4) 1M NaOH中處理5分鐘，充分清洗至中性。
[0067] 凍干，即得本發(fā)明的有序膠原材料（Linear ordered collagen scaffolds, L0CS) 〇
[0068] (二）材料的形態(tài)
[0069] 所得的有序膠原材料L0CS為白色片狀形態(tài)，還可以將其制備為有序的管狀或者 膠原纖維。L0CS的形態(tài)圖如圖1所示，圖1中A、B分別表示片狀和纖維狀的L0CS，圖1中 C為L(zhǎng)0CS的掃描電鏡照片。從圖中可以看出，L0CS保持了天然膠原纖維的結(jié)構(gòu)，其電鏡照 片顯示了它具有有序的表面結(jié)構(gòu)，其粗糙的表面結(jié)構(gòu)也有利于細(xì)胞的粘附。
[0070] 二、帶有膠原結(jié)合區(qū)的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF-CBD)的制備
[0071] 1、構(gòu)建帶有VEGF-CBD的表達(dá)載體
[0072] (1)人工合成編碼VEGF-CBD蛋白（序列1的第1-184位）的基因序列（序列2的 第3-554位），并在5'端增加核苷酸CC，形成酶切位點(diǎn)Nco I的識(shí)別序列，在3'端增加酶 切位點(diǎn)Xho I的識(shí)別序列CTCGAG，得到序列表中序列2的第1-560位，將其所示DNA片段記 為DNA片段1。
[0073] (2)用限制性?xún)?nèi)切酶Nco I和Xho I雙酶切DNA片段1，回收酶切片段與經(jīng)過(guò)同 樣雙酶切的pET28a載體（購(gòu)自Novagen公司，貨號(hào)：69864-3)的骨架大片段相連，得到重 組質(zhì)粒。將經(jīng)測(cè)序表明將pET28a載體的酶切位點(diǎn)Nco I和Xho I之間的小片段替換為序 列表中序列2的第7-554位所示DNA片段的重組質(zhì)粒命名為pET-VEGF-CBD。在重組表達(dá) 載體pET-VEGF-CBD中，VEGF-CBD基因的下游連接有6個(gè)His標(biāo)簽。帶有6個(gè)His標(biāo)簽的 VEGF-CBD-6His融合蛋白的氨基酸序列為序列表中序列1，其對(duì)應(yīng)的編碼基因（0RF)的序列 為序列表中序列2的第3-581位。
[0074] 參照上述方法構(gòu)建得到重組表達(dá)載體pET-VEGF。重組表達(dá)載體pET-VEGF的結(jié)構(gòu) 描述為：將pET28a載體的酶切位點(diǎn)Nco I和Xho I之間的小片段替換為序列表中序列2的 第7-500位所示DNA片段后得到的重組質(zhì)粒。
[0075] 2、VEGF-CBD的表達(dá)及純化
[0076] 將步驟1構(gòu)建的重組表達(dá)載體pET-VEGF-CBD轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì) 胞（全式金公司產(chǎn)品，其產(chǎn)品目錄號(hào)為⑶601-01)。轉(zhuǎn)至LB培養(yǎng)基中，在37°C，200rpm培 養(yǎng)12小時(shí)左右，然后按2ml/100ml的比例將培養(yǎng)的重組菌接種到150ml新鮮LB培養(yǎng)基，在 37°C，200rpm培養(yǎng)3小時(shí)左右，當(dāng)0D 6。。達(dá)到0? 8-1時(shí)，加入誘導(dǎo)物IPTG(IPTG終濃度ImM) 誘導(dǎo)5小時(shí)。8000g離心10min收集菌體。100W超聲破碎菌體，離心分離沉淀，沉淀溶解于 含有尿素（終濃度8M)的Tris緩沖液中，以氧化還原體系進(jìn)行蛋白復(fù)性。復(fù)性后的蛋白以 鎳柱親和層析，咪唑梯度洗脫分離后，用脫鹽柱將鹽去除，獲得VEGF-CBD。
[0077] 參照上述方法將重組表達(dá)載體pET-VEGF轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞，獲 得VEGF蛋白。
[0078] 3、VEGF-CBD的生物活性測(cè)定
[0079] 為了測(cè)定VEGF-CBD的生物活性，分離人內(nèi)皮細(xì)胞，分離培養(yǎng)方法：將人臍帶分離 后，用PBS緩沖液沖洗內(nèi)壁，將血細(xì)胞去除，然后臍帶內(nèi)灌入0. 25%的胰酶，兩邊用止血鉗 封閉，37°C放置15分鐘，然后將胰酶消化后的液體收集，并用PBS沖洗內(nèi)壁數(shù)十下，液體一 并收集，離心后所得細(xì)胞在20%胎牛血清及10即/1111￥￡6?及1〇1^/1111&?6?的組99培養(yǎng) 基中培養(yǎng)，擴(kuò)增后即為人臍帶內(nèi)皮細(xì)胞，培養(yǎng)于48孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，加入等摩爾（0、1、2、3、 4和5nM)的VEGF-CBD或VEGF，三天后通過(guò)MTT檢測(cè)細(xì)胞的增值情況。
[0080] 可以看到隨VEGF及VEGF-CBD的濃度增高，內(nèi)皮細(xì)胞呈梯度依賴(lài)性增殖，且與VEGF 相比，VEGF-CBD的活性沒(méi)有顯著性差異，證明VEGF-CBD具有生物活性。
[0081] 三、含VEGF-CBD因子的外周神經(jīng)損傷功能修復(fù)膠原支架的制備
[0082] 1、膠原管的制備
[0083] 取直徑為1mm的玻璃管（根據(jù)所要修復(fù)神經(jīng)損傷部位的半徑，找到相同半徑的模 具），將膠原膜剪成適宜的尺寸，用三蒸水浸泡2min，以使膠原膜軟透，將膠原膜繞模具纏 繞5/4圈，繞好后用液態(tài)膠原涂裹一圈，過(guò)夜風(fēng)干。室溫