（25°C )過夜（12小時(shí)）交聯(lián)，交 聯(lián)之后將膠原管從玻璃管上取下來，交聯(lián)完成后先用NaH2P04溶液（0. 1M，溶劑為水）洗滌5 次，再用去離子水洗滌5次，凍干、輻射（輻射劑量具體可為8kGy)后備用。
[0084] 2、含有VEGF-CBD因子的修復(fù)外周神經(jīng)損傷的膠原材料的制備
[0085] 將0? 2nmol純化后的VEGF-CBD溶解于5微升1 X PBS (1 X PBS的pH為7. 4,溶劑 為水，溶質(zhì)及其濃度如下：磷酸二氫鉀〇. 27g/L，磷酸氫二鈉1. 42g/L，氯化鈉8g/L，氯化鉀 0. 2g/L)中，然后滴加到5mg步驟一用牛筋膜制備的有序膠原材料，25°C孵育半小時(shí)，使溶 液全部被L0CS吸收，得到含有VEGF-CBD因子的修復(fù)外周神經(jīng)損傷的膠原材料。
[0086] 3、組裝
[0087] 將步驟2獲得的含有VEGF-CBD因子的修復(fù)外周神經(jīng)損傷的膠原材料，切成5毫米 長(zhǎng)；將步驟1獲得的膠原管切成7毫米長(zhǎng)，并通過8kGy放射除菌（圖2)。將切好的膠原材 料填充在切好的膠原管中，填充約占一半空間（因?yàn)樯窠?jīng)的再生也需要空間），即獲得了含 有VEGF-CBD因子的外周神經(jīng)損傷功能修復(fù)膠原支架。
[0088] 四、不含因子的外周神經(jīng)損傷功能修復(fù)膠原支架的制備
[0089] 1、膠原管的制備
[0090] 同步驟三1。
[0091] 2、不含因子的修復(fù)外周神經(jīng)損傷的膠原材料的制備
[0092] 將5微升1XPBS (配方同上）滴加到10mg步驟一用牛筋膜制備的有序膠原材料， 25°C孵育半小時(shí)，使溶液全部被L0CS吸收，得到不含因子的修復(fù)外周神經(jīng)損傷的膠原材 料。
[0093] 3、組裝
[0094] 將步驟2獲得的不含因子的修復(fù)外周神經(jīng)損傷的膠原材料，切成5毫米長(zhǎng)。將步 驟1獲得的膠原管切成7毫米長(zhǎng)，并通過8kGy放射除菌。將切好的膠原材料填充在切好的 膠原管中，填充約占一半空間（因?yàn)樯窠?jīng)的再生也需要空間），即獲得了不含因子的外周神 經(jīng)損傷功能修復(fù)膠原支架。
[0095] 實(shí)施例2、應(yīng)用外周神經(jīng)損傷功能修復(fù)膠原支架治療SD大鼠的橫斷坐骨神經(jīng)損傷
[0096] -、制備SD大鼠的坐骨神經(jīng)橫斷損傷模型，將外周神經(jīng)損傷功能修復(fù)膠原支架材 料橋接在神經(jīng)損傷兩端
[0097] 1、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
[0098] 購買成年雄性SD大鼠60只，體重在200到220g之間，SD大鼠購自維通利華公司。 在手術(shù)前的耗材準(zhǔn)備如下：手術(shù)用針線，無菌濾紙，鼠板，中性筆，手表，彎頭剪，圓頭剪，直 鑷，直剪，眼科剪，眼科鑷，手術(shù)刀片、刀柄，止血鉗，鐘表鑷，無菌洞巾，針頭濾器，一次性注 射器，一次性細(xì)菌皿，戊巴比妥鈉，生理鹽水，PBS，75%乙醇，小燒杯，蒸餾水，垃圾袋，慶大 霉素，50ml離心管，玻璃小瓶，槍頭，500 ii LEP管，封口膜，移液槍，微量移液器，錫箔紙，直 尺，皮筋，相機(jī)，繩子，計(jì)時(shí)器，止血海綿，紗布，標(biāo)簽紙，筆，無菌手套，口罩，酒精棉球，冰盒， 充電器。
[0099] 2、坐骨神經(jīng)橫斷傷手術(shù)
[0100] 將戊巴比妥鈉按10毫克/毫升的濃度溶解于0. 9%的生理鹽水中。SD大鼠通過 腹腔內(nèi)注射戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉（40mg/kg體重）。將SD大鼠用橡皮筋固定在鼠板上。采 用常規(guī)消毒鋪單，取右側(cè)股后部縱行切口，用手術(shù)刀切開皮膚，將肌肉鈍性分離，由股后外 側(cè)肌間隙顯露右側(cè)坐骨神經(jīng)，在坐骨神經(jīng)距梨狀肌出口 5_處用顯微剪減去3_長(zhǎng)度的神 經(jīng)，由于神經(jīng)的回縮可形成5毫米的缺損。
[0101] 根據(jù)治療方法的不同，本發(fā)明共包括4個(gè)實(shí)驗(yàn)組。每組大鼠至少5只：
[0102] (l)VEGF-CBD組：將實(shí)施例1制備得到的含VEGF-CBD因子的外周神經(jīng)損傷功能修 復(fù)膠原支架用9-0的帶針縫合線橋接神經(jīng)的近遠(yuǎn)兩個(gè)斷端，兩個(gè)斷端各遷入導(dǎo)管內(nèi)1_。
[0103] (2) PBS組：將實(shí)施例1制備得到的不含因子的外周神經(jīng)損傷功能修復(fù)膠原支架用 9-0的帶針縫合線橋接神經(jīng)的近遠(yuǎn)兩個(gè)斷端，兩個(gè)斷端各遷入導(dǎo)管內(nèi)1_。
[0104] (3)空管組（Empty tube):只移植空的實(shí)施例1制備得到的7mm膠原管，不含有 L0CS〇
[0105] (4)自體神經(jīng)移植組（Autograft):將自體坐骨神經(jīng)剪斷后縫合。
[0106] 最后將大鼠的肌肉和皮膚分別縫合。手術(shù)后將大鼠飼養(yǎng)在標(biāo)準(zhǔn)的動(dòng)物房。飼養(yǎng)間 溫度維持在25°C左右，安靜，無菌。飼養(yǎng)期間大鼠規(guī)律地給予飼料和水。每天觀察動(dòng)物的生 長(zhǎng)狀況。
[0107] 二、術(shù)后外周神經(jīng)再生情況的檢測(cè)
[0108] 1、外周神經(jīng)再生情況的觀察
[0109] 手術(shù)剛剛完成時(shí)如圖3中A所示。在術(shù)后第12周，VEGF-CBD組和PBS組，可以看 到所使用的膠原管已經(jīng)降解，被類似神經(jīng)的組織所代替。神經(jīng)的近遠(yuǎn)斷端之間正常連接。神 經(jīng)與周圍組織之間無嚴(yán)重粘連，神經(jīng)兩斷端沒有形成明顯的膨大（圖3中B)。
[0110] 2、坐骨神經(jīng)功能指數(shù)（Sciatic nerve function index，SFI)檢測(cè)
[0111] (1)實(shí)驗(yàn)方法
[0112] 對(duì)大鼠坐骨神經(jīng)功能恢復(fù)的檢測(cè)是根據(jù)Bain等（Bain, J. R. ;Mackinnon, S. E. ；Hunter, D. A. ,Functional evaluation of complete sciatic,peroneal,and posterior tibial nerve lesions in the rat Plastic and reconstructive surgery 198983(1) 129-38)的前期研究進(jìn)行的，在手術(shù)后每周檢測(cè)大鼠坐骨神經(jīng)功能指數(shù)。過程簡(jiǎn) 述如下。用紙箱做一個(gè)暗室，暗室的一面開口，開口處連接一紙板做的封閉走道。走道的長(zhǎng) 度、寬度、高度分別為60厘米、12厘米、12厘米。在功能測(cè)試前準(zhǔn)備一長(zhǎng)為70厘米的大白 紙，鋪于走道底。先讓大鼠在地上自由走行，一段時(shí)間后將大鼠的雙側(cè)腳蹼用黑色染料染 黑，將大鼠放在走道的一端讓其自由沿著走道行走直到鉆進(jìn)暗室內(nèi)。雙側(cè)的腳印留在白紙 上。將白紙收回后，分別測(cè)量左側(cè)足（正常側(cè)足）（N)和右側(cè)足（實(shí)驗(yàn)側(cè)足）（E)的相關(guān)數(shù) 值。其中足印長(zhǎng)度（print length,PL)為從足跟到足尖的距離；足趾寬度（width between the first and fifth toes, TS)為第1趾到第5趾連線距離；中間足趾距離（inter-toes distance, IT)為第2趾到第4趾連線距離。坐骨神經(jīng)功能指數(shù)（Sciatic nerve function index, SFI)的計(jì)算公式為：
[0113] SFI = 109. 5(ETS-NTS)/NTS-38. 3(EPL-NPL)/NPL+13. 3(EIT-NIT)/NIT-8. 8
[0114] ETS代表右側(cè)足的足趾寬度，EPL代表右側(cè)足的足印長(zhǎng)度，EIT代表右側(cè)足的中間 足趾距離；NTS代表左側(cè)足的足趾寬度，NPL代表左側(cè)足的足印長(zhǎng)度，NIT代表左側(cè)足的中間 足趾距離。SFI = 0為正常，-100為功能的完全喪失。
[0115] ⑵結(jié)果
[0116] 坐骨神經(jīng)功能指數(shù)可以反映大鼠功能恢復(fù)的情況，第12周時(shí)，其患側(cè)的腳印見圖 4中A。通過公式算得各組的坐骨神經(jīng)功能指數(shù)并將其做成曲線。當(dāng)坐骨神經(jīng)功能指數(shù)為 〇時(shí)代表神經(jīng)功能的完全恢復(fù)，而當(dāng)坐骨神經(jīng)功能指數(shù)為-100時(shí)表示神經(jīng)功能的完全缺 失。大鼠坐骨神經(jīng)橫斷傷后的第一周三個(gè)組的坐骨神經(jīng)功能指數(shù)都接近-100,這表示手 術(shù)造模是成功的。在三個(gè)組，隨著時(shí)間的推移坐骨神經(jīng)功能指數(shù)均有增大的趨勢(shì)，但是在 OCFs+VEGF-CBD組其增長(zhǎng)明顯快于其它兩個(gè)組，與自體神經(jīng)移植組類似（圖4中B)。
[0117] 3、電生理學(xué)檢測(cè)
[0118] (1)實(shí)驗(yàn)方法
[0119] 手術(shù)后12周對(duì)大鼠進(jìn)行了電生理學(xué)神經(jīng)傳導(dǎo)速度（nerve conduction velocity, NCV)的測(cè)試。實(shí)驗(yàn)時(shí)所采用的儀器是成都儀器廠生產(chǎn)的RM6240USB2.0Z型肌電誘發(fā)電位儀 描記NCV。將大鼠按之前的方法麻醉，切開皮膚重新暴露出坐骨神經(jīng)，用塑料手套墊在坐骨 神經(jīng)下，使神經(jīng)與周圍的組織隔開以減少干擾。調(diào)整好儀器的各種參數(shù)。將雙刺激電極放 在再生坐骨神經(jīng)的近端，兩記錄電極分別放在距離縫合線段的近遠(yuǎn)端，其中近端的記錄電 極與雙刺激電極應(yīng)保持適當(dāng)?shù)木嚯x。參考電極夾在大鼠皮下。記錄好兩記錄電極之間的距 離。在雙刺激電極上給予刺激。記錄電極將分別呈現(xiàn)不同的波幅變化，根據(jù)近端和遠(yuǎn)端兩 點(diǎn)之間的距離，計(jì)算NCV。
[012