0] ⑵結(jié)果
[0121] 在坐骨神經(jīng)損傷修復(fù)的第12周，對電生理測試的統(tǒng)計，各組在術(shù)后均有不同程度 的恢復(fù)。其神經(jīng)傳導(dǎo)速度從空管組到正常神經(jīng)組織呈現(xiàn)遞增的趨勢。修復(fù)組比正常神經(jīng)的 傳導(dǎo)速度要低，OCFs+VEGF-CBD組其增長明顯快于其它兩個組，與自體神經(jīng)移植組類似（圖 5)。
[0122] 4、熒光金逆行示蹤檢測
[0123] (1)實驗方法
[0124] 在手術(shù)后的10周。將大鼠麻醉，重新暴露坐骨神經(jīng)。將3微升5 %的熒光金（5 毫克/100微升，F(xiàn)luorochrome, Inc.，Denver, C0)用微量進樣器緩慢注射到神經(jīng)的遠端，注 射完畢后停留30秒，緩慢拔出微量進樣器。將肌肉和皮膚縫合后，大鼠仍按之前的情況飼 養(yǎng)。兩周后將大鼠通過過量麻醉處死。分離并取出L4、L5、L6的脊髓背根神經(jīng)節(jié)dorsal rootganglia (DRGs)。將取出的背根神經(jīng)節(jié)用冷凍包埋劑包埋，隨后將其用液氮冰凍用作冰 凍切片。將每個背根神經(jīng)節(jié)切成10微米厚，并貼于載玻片上，在熒光倒置顯微鏡（Axiovert 200,德國）下觀察。計數(shù)具有細胞形態(tài)并發(fā)金黃色熒光的神經(jīng)元的數(shù)量。
[0125] (2)結(jié)果
[0126] 術(shù)后，對大鼠進行逆行示蹤，并在第12周取材觀察。發(fā)現(xiàn)，在紫外激發(fā)下，被熒光 金標記的神經(jīng)元呈現(xiàn)金黃色。通過對所標記的感覺神經(jīng)元的計數(shù)可知。在各組中，空管組 被標記的神經(jīng)元數(shù)量最低，而在正常大鼠的背根神經(jīng)節(jié)中被標記的神經(jīng)元數(shù)量最高。被標 記的感覺神經(jīng)元在OCFs+VEGF-CBD組其增長明顯快于其它兩個組，與自體神經(jīng)移植組類似 (圖 6)。
[0127] 5、形態(tài)和組織學(xué)觀察
[0128] (1)實驗方法
[0129] A.熒光檢測
[0130] 移植治療12周，大鼠通過過量麻醉處死后，迅速將新生神經(jīng)取出，4%的多聚甲醛 (購自北京化學(xué)試劑公司）4°C固定過夜（12小時以上），轉(zhuǎn)移到20%的蔗糖（4°C，3天，試劑 購自北京化學(xué)試劑公司）和30 %蔗糖（4°C，3天）。液氮冷凍后，切成10 y m厚的切片，每片 組織滴加正常山羊血清（欣博盛公司產(chǎn)品，其產(chǎn)品目錄號為ENS004. 120)封閉液封閉，放入 濕盒內(nèi)37°C下孵育15分鐘。吸去封閉血清，不要洗滌。標本與神經(jīng)絲蛋白-200 -抗體染 色（NF，1:500稀釋，Abeam，貨號ab7795)或大鼠血管內(nèi)皮細胞胞漿抗原（RECA-1，1:100稀 釋，Serotec公司，貨號MCA970R)4°C過夜，PBS漂洗3次，每次5分鐘。加入Alexa 495-驢 抗兔二次抗體（1:100稀釋，Invitrogen公司，貨號A-11055)或Alexa 594標記的驢抗小鼠 抗體（1:100稀釋，Invitrogen公司，貨號A-11020)孵育lh，PBS漂洗3次，每次5分鐘。 加入0. 5-10iig/ml Hoechst33342(購自碧云天公司，貨號C1022)是用于核染色。染色切 片在激光掃描共聚焦熒光顯微鏡觀察（徠卡）。
[0131] B.免疫組織化學(xué)染色
[0132] 移植治療12周，大鼠通過過量麻醉處死后，迅速將新生神經(jīng)取出，于10%福爾馬 林固定液中固定48小時。石蠟包埋后做切片，進行S-100蛋白的免疫組織化學(xué)染色。使用 多聚賴氨酸處理過的玻片粘片，將切片在烤片機上與56°C烘烤3小時。進行免疫組織化學(xué) 染色時需要經(jīng)歷下述步驟：依次為二甲苯I，15分鐘；二甲苯II，15分鐘；二甲苯/乙醇（體 積比1:1)，5分鐘；100%乙醇，5分鐘；95%乙醇，5分鐘；80%乙醇，5分鐘；70%乙醇，5分 鐘；50 %乙醇，5分鐘；自來水，5分鐘；蒸餾水，5分鐘。PBS浸泡3次，每次5分鐘。將抗原 修復(fù)液（配制方法：檸檬酸三鈉3克，檸檬酸0. 4克，加蒸餾水至1L，調(diào)pH = 6. 0,所有試劑 均購自北京化學(xué)試劑公司）煮沸，組織片放入煮沸的抗原修復(fù)液中并維持10分鐘，讓組織 片緩慢冷卻至室溫。用PBS洗滌3次，每次3分鐘。用免疫組化筆在組織周圍畫圈，樣本周 圍用吸水紙吸干。滴加3% H202去離子水，放入濕盒內(nèi)37°C下孵育10分鐘，以阻斷內(nèi)源過 氧化物酶。PBS漂洗3次，每次5分鐘。每片組織滴加正常山羊血清（欣博盛公司產(chǎn)品，其 產(chǎn)品目錄號為ENS004. 120)封閉液封閉，放入濕盒內(nèi)37°C下孵育15分鐘。吸去封閉血清， 不要洗滌。加小鼠來源的anti-S-100 (Sigma公司產(chǎn)品，其產(chǎn)品目錄號為S2644,稀釋體積比 1:100)，4°C孵育過夜后，PBS漂洗3次，每次5分鐘。加生物素化二抗（欣博盛公司產(chǎn)品，其 產(chǎn)品目錄號為ENS004. 120)，放入濕盒內(nèi)37°C孵育15分鐘后，PBS漂洗3次，每次5分鐘。 加三抗（欣博盛公司產(chǎn)品，其產(chǎn)品目錄號為ENS004. 120)，放入濕盒內(nèi)37°C孵育15分鐘后， 每個樣品加適量新鮮配置的DAB溶液（欣博盛公司產(chǎn)品，其產(chǎn)品目錄號為ENS004. 120)，室 溫反應(yīng)10分鐘，棄掉反應(yīng)液，自來水終止。50%乙醇中放置5分鐘；70%乙醇中放置5分 鐘；80%乙醇中放置5分鐘；95%乙醇中放置5分鐘；95%乙醇中放置5分鐘；100%乙醇中 放置5分鐘；100%乙醇中放置5分鐘；乙醇/二甲苯（體積比1:1)中放置5分鐘；二甲苯 I中放置10分鐘；二甲苯II中放置5分鐘；中性樹膠封片，顯微鏡觀察，照相。
[0133] NF是對軸突的特異性染色，RECA-1染色可以顯示血管再生情況，S-100特異性染 色能顯示出施萬細胞的再生情況，在統(tǒng)計中用染色的陽性面積與視野下圖片總面積的比例 來進行分析。
[0134] (2)結(jié)果
[0135] 從圖中可以看出，在空管組，NF、RECA-1和S-100陽性面積在各組中的比例均最 低。而在LOCS+VEGF-CBD組陽性面積顯最高，在三個修復(fù)組中最為接近正常神經(jīng)的陽性面 積比例。通過該項檢測，可以知道，OCFs+VEGF-CBD能更有效地促進血管和神經(jīng)再生（圖7)。
[0136] 6、形態(tài)學(xué)與再生神經(jīng)的髓鞘分析
[0137] (1)實驗方法
[0138] 在手術(shù)后的第12周，將再生神經(jīng)取材并切片后對其進行組織形態(tài)學(xué)的觀察。首先 做常規(guī)蘇木素伊紅染色01E)以觀察再生神經(jīng)在導(dǎo)管內(nèi)生長的情況。然后，通過堅牢藍染色 和電鏡檢測，對新生神經(jīng)的直徑、數(shù)量的多少和髓鞘的厚度進行分析，對三項指標分別進行 統(tǒng)計。
[0139] A?蘇木素-伊紅染色（HE)
[0140] 在坐骨神經(jīng)損傷后12周，分別將大鼠用過量麻醉處死后，迅速將新生神經(jīng)取出并 將其固定于10%福爾馬林固定液。進行石蠟包埋后，將組織塊切片，厚度為5微米。將薄片 貼附于使用多聚賴氨酸處理過的玻片上。將載玻片放在烤片機上于56°C烘烤3小時。用 二甲苯脫蠟。依次為二甲苯I，15分鐘；二甲苯II，15分鐘；二甲苯/乙醇（體積比1:1)，5 分鐘；無水酒精I，5分鐘；無水酒精II，5分鐘；95%酒精，5分鐘；80%酒精，5分鐘；75%酒 精，5分鐘；50%酒精，5分鐘；ddH 20洗滌3次，每次5分鐘；蘇木素染色，5分鐘；自來水沖洗 5分鐘；ddH20浸泡2次，每次5分鐘；酸性水分化，約3秒，變紅即可；自來水沖洗數(shù)分鐘至 數(shù)小時，直至切片組織呈現(xiàn)藍色；50%酒精，5分鐘；70%酒精，5分鐘；80%酒精，5分鐘；伊 紅染色，3分鐘；95%酒精，5分鐘；95%酒精，5分鐘；無水酒精I，5分鐘；無水酒精II，5分 鐘；乙醇/二甲苯（體積比1:1)，5分鐘；二甲苯I，10分鐘；二甲苯II，5分鐘；中性樹膠封 片，顯微鏡觀察，照相。
[0141] B.坐骨神經(jīng)的髓鞘堅牢藍染色（LFB)
[0142] 在手術(shù)后第12周將大鼠通過過量麻醉處死后，迅速將坐骨神經(jīng)受損部位取出，于 10%福爾馬林固定液中固定兩天。通過石蠟包埋后將樣品切成5微米的半薄切片，使用多 聚賴氨酸處理過的玻片粘片，在烤片機上烤片數(shù)小時。將組織片依次通過如下處理：二甲 苯I，15分鐘；二甲苯II，15分鐘；二甲苯/乙醇（體積比1:1)，5分鐘；100%乙醇，5分鐘； 95%乙醇，5分鐘；將組織片放入監(jiān)牢藍中與37°C過夜；95%乙醇洗滌兩次，每次3分鐘。蒸 餾水洗干凈；用免疫組化筆在組織周圍畫圈；將〇. 05%的LiC03滴加在組織片上5秒；蒸餾 水洗滌；70%乙醇分化10秒；蒸餾水洗滌；顯微鏡下觀察，重復(fù)5-7次直至髓鞘與周圍組織 形成鮮明的對比；組織片在〇. 5%伊紅中浸1秒；蒸餾水洗滌；0. 25%的結(jié)晶紫中浸1秒；蒸 餾水中洗滌；70%乙醇分化10秒；蒸餾水洗滌；50%酒精中放置5分鐘；70%酒精中放置5 分鐘；80%酒精中放置5分鐘；95%酒精中放置5分鐘；95%酒精中放置5分鐘；100%酒精 中放置5分鐘；100%酒精中放置