5分鐘；乙醇/二甲苯1:1 (體積比1:1)，5分鐘；二甲苯 I，10分鐘；二甲苯II，5分鐘；中性樹膠封片，顯微鏡觀察，照相。利用Image-Pro Plus軟 件（Media Cybernetics)統(tǒng)計(jì)再生髓鞘的數(shù)目和直徑大小。
[0143] C.再生神經(jīng)的透射電鏡觀察（TEM)
[0144] 移植治療的第12周，將大鼠通過(guò)過(guò)量麻醉處死后，新生坐骨神經(jīng)被取出用于做透 射電鏡觀察。具體操作如下：將神經(jīng)置于2. 5%戊二醛溶液（體積分?jǐn)?shù)，溶劑為水）中固定 2 小時(shí)；用 0? 1M 磷酸漂洗液（配制方法：NaCl 80g，Na2HP04 ? 12H20 32. 3g，NaH2P04 ? 2H20 4. 5g，溶于1L水中，pH 7. 0。所有化學(xué)試劑均購(gòu)自北京化學(xué)試劑公司）漂洗三次，每次15 分鐘；在1%鋨酸固定液（配制方法：lg鋨酸溶于100ml水中。鋨酸購(gòu)自sigma公司，產(chǎn)品 目錄號(hào)419494)中固定2小時(shí)；用0. 1M磷酸漂洗液（配方同上）漂洗三次，每次15分鐘； 在4°C冰箱內(nèi)將組織在不同濃度的酒精中進(jìn)行梯度脫水：放置50%酒精中15-20分鐘；在 70%酒精中放置15-20分鐘；90%酒精中放置15-20分鐘；90%酒精+90%丙酮（體積比1 : 1)酒精中放置15-20分鐘；90%丙酮酒精中放置15-20分鐘；在100%丙酮中于室溫放置 15-20分鐘，一共放置三次；組織包埋：純丙酮+包埋液（體積比2 :1)室溫4小時(shí)；純丙酮 +包埋液（體積比1 :2)室溫過(guò)夜；純包埋液，37°C 3小時(shí)；固化：37°C烘箱內(nèi)過(guò)夜；45°C烘 箱12小時(shí)，60°C烘箱內(nèi)24小時(shí)；用超薄切片機(jī)將組織切成50-60nm的切片。使用1%醋酸 鈾-檸檬酸鹽（1 %醋酸雙氧鈾染液配制方法：稱醋酸雙氧鈾〇. 2g，加雙蒸水到10mL，封口 膜封口，4°C避光保存。1%檸檬酸鉛染液配制方法：稱硝酸鉛0.265g，檸檬酸鈉（含2分子 結(jié)晶水）0. 352g，加雙蒸水到10mL，封口膜封口，4°C避光保存。產(chǎn)品名稱：檸檬酸鉛，貨號(hào)： GA10701 ;產(chǎn)品名稱：醋酸雙氧鈾，貨號(hào)：GS02625。）雙染色。其中，包埋液（中鏡科儀公司 產(chǎn)品，產(chǎn)品名稱EMbed 812環(huán)氧樹脂包埋套裝貨號(hào)：GE14120)。完成上述步驟之后使用透射 電鏡觀察和拍照。通過(guò)比較各治療組的髓鞘直徑大小和髓鞘壁厚度評(píng)價(jià)各組的治療效果。 每個(gè)組織隨機(jī)選取3個(gè)不同視野，通過(guò)Image-Pro Plus軟件對(duì)髓鞘直徑大小和髓鞘壁厚度 進(jìn)行定量，定量柱狀圖通過(guò)GraphPad Prism 5軟件繪制。
[0145] (2)結(jié)果
[0146] 蘇木素伊紅染色（HE)結(jié)果顯示，在使用了有序膠原材料在各組神經(jīng)呈現(xiàn)有序的 生長(zhǎng)，組織片上的細(xì)胞排列類似正常神經(jīng)。這說(shuō)明，有序膠原材料能夠有效地引導(dǎo)神經(jīng)沿著 材料有序生長(zhǎng)。通過(guò)堅(jiān)牢藍(lán)染色和電鏡可以得出，再生神經(jīng)的軸突在各組中呈現(xiàn)出高密度， 輪廓清晰的形態(tài)特征。通過(guò)測(cè)量髓鞘的厚度可見，再生神經(jīng)的厚度在OCFs+VEGF-CBD組大 于其它兩組（圖8)。
[0147] 7、腓腸肌恢復(fù)率和馬松三色染色
[0148] (1)實(shí)驗(yàn)方法
[0149] 在手術(shù)后的第12周，將大鼠通過(guò)過(guò)量麻醉處死。立即分離并剪下大鼠雙側(cè)的腓腸 肌，在電子天平上稱得濕重記錄雙側(cè)腓腸肌的重量，將右側(cè)腓腸肌的重量除以左側(cè)腓腸肌 的重量從而得到一個(gè)比值，稱之為腓腸肌的恢復(fù)率。稱重后將腓腸肌的中段取下并固定于 10%福爾馬林固定液中。經(jīng)過(guò)石蠟包埋并切成5微米的薄切片。切片按照廠家的提示步驟 進(jìn)行馬松三色染色。將組織片放二甲苯I中15分鐘；之后在二甲苯II放置15分鐘；在二 甲苯/乙醇（體積比1:1)中放置5分鐘；100%乙醇中5分鐘；95%乙醇中5分鐘；80%乙 醇中5分鐘；70%乙醇中5分鐘；50%乙醇中5分鐘；自來(lái)水中洗滌5分鐘；蒸餾水中浸泡 5分鐘。PBS洗滌3次，每次5分鐘；用蘇木素染色液/三氯化鐵水溶液（體積比1:1)染色 5-10分鐘；傾去后用蒸餾水洗滌5分鐘；鹽酸乙醇分化液分化3-5秒；傾去后用蒸餾水洗滌 數(shù)秒；加氨水返藍(lán)為肉眼可見的藍(lán)色；傾去后用蒸餾水洗滌5分鐘；麗春紅酸性品紅染色液 染色5-10分鐘；傾去后用蒸餾水洗滌5分鐘；加乙酸水溶液1分鐘；傾去后用蒸餾水洗滌5 分鐘；加磷鑰酸水溶液1-2分鐘；傾去后用蒸餾水洗滌5分鐘；加乙酸水溶液1分鐘；直接 放入苯胺藍(lán)染色液染色1-2分鐘；傾去后用蒸餾水洗滌5分鐘；乙酸水溶液洗滌1分鐘；傾 去后用蒸餾水洗滌5分鐘；50%乙醇中5分鐘；70%乙醇中5分鐘；80%乙醇中5分鐘；95% 乙醇中5分鐘；95%乙醇中5分鐘；100%乙醇中5分鐘；100%乙醇中5分鐘；乙醇/二甲 苯（體積比1:1)中5分鐘；二甲苯I中10分鐘；二甲苯II中5分鐘；中性樹膠封片，顯微 鏡觀察，照相。
[0150] (2)結(jié)果
[0151] 在神經(jīng)功能材料移植后的第12周。腓腸肌在失神經(jīng)支配后會(huì)發(fā)生萎縮，隨著神經(jīng) 的再生，萎縮的肌肉也會(huì)隨著恢復(fù)。稱量了腓腸肌的濕重并得到恢復(fù)率（損傷側(cè)/健側(cè)） 正常大鼠雙側(cè)腓腸肌重量的比值為1。從圖中得知，恢復(fù)率在OCFs+VEGF-CBD組較其它兩 組高。之后對(duì)腓腸肌進(jìn)行了馬松三色染色，圖中紅色為肌肉纖維，綠色為膠原纖維，對(duì)肌肉 的陽(yáng)性面積比（紅色區(qū)域面積/總面積）進(jìn)行分析。在OCFs+VEGF-CBD組，肌肉的陽(yáng)性面 積比接近正常肌肉。這些結(jié)果提示，新構(gòu)建的神經(jīng)功能材料能更有效地促進(jìn)靶器官的恢復(fù) (圖 9)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種制備用于修復(fù)外周神經(jīng)損傷的膠原材料的方法，包括如下步驟：將帶有膠原結(jié) 合區(qū)的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子與有序膠原材料共同孵育，得到所述用于修復(fù)外周神經(jīng)損傷的膠 原材料。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述帶有膠原結(jié)合區(qū)的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因 子和所述有序膠原材料的配比為：〇. 2nmol :l-10mg。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述孵育為10-37°C孵育0. 5-1小 時(shí)。4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述孵育時(shí)的液體環(huán)境為 lXPBS〇5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：所述帶有膠原結(jié)合區(qū)的血管內(nèi) 皮生長(zhǎng)因子的氨基酸序列為如下（a)或（b): (a) 序列表中序列1的第1-184位； (b) 序列表中序列1。6. 利用權(quán)利要求1-5中任一所述的方法制備得到的用于修復(fù)外周神經(jīng)損傷的膠原材 料。7. 用于修復(fù)外周神經(jīng)損傷的膠原支架的制備方法，包括如下步驟： (1) 根據(jù)待修復(fù)外周神經(jīng)損傷部位的半徑，采用膠原膜制備相同半徑的膠原管； (2) 向步驟（1)制備得到的膠原管中填充權(quán)利要求6所述的用于修復(fù)外周神經(jīng)損傷的 膠原材料，即獲得了所述用于修復(fù)外周神經(jīng)損傷的膠原支架。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于：步驟（1)為：根據(jù)待修復(fù)外周神經(jīng)損傷部 位的半徑，找到相同半徑的模具，將膠原膜用水浸泡，將浸泡過(guò)的膠原膜裹在所述模具上形 成管狀，然用液態(tài)膠原涂裹一圈，風(fēng)干，10~30°C放置12小時(shí)使之交聯(lián)，去除所述模具，獲 得所述膠原管。9. 利用權(quán)利要求7或8所述方法制備得到的用于修復(fù)外周神經(jīng)損傷的膠原支架。10. 權(quán)利要求6所述的用于修復(fù)外周神經(jīng)損傷的膠原材料，或權(quán)利要求9所述的用于修 復(fù)外周神經(jīng)損傷的膠原支架在如下任一中的應(yīng)用： (al)制備促進(jìn)外周神經(jīng)再生的材料； (a2)制備促進(jìn)受損的外周神經(jīng)功能指數(shù)恢復(fù)的材料； (a3)制備促進(jìn)外周神經(jīng)橫斷部位電生理恢復(fù)的材料； (a4)制備促進(jìn)外周神經(jīng)受損部位S-100蛋白和/或神經(jīng)絲蛋白表達(dá)的材料； (a5)制備促進(jìn)外周神經(jīng)受損部位髓鞘直徑和/或髓鞘壁厚度增加的材料； (a6)制備促進(jìn)靶器官恢復(fù)的材料。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種制備用于修復(fù)外周神經(jīng)損傷的膠原材料的方法。本發(fā)明所提供的方法包括如下步驟：將帶有膠原結(jié)合區(qū)的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子與有序膠原材料共同孵育，得到所述用于修復(fù)外周神經(jīng)損傷的膠原材料。實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明所提供的含VEGF-CBD因子的外周神經(jīng)損傷修復(fù)膠原材料，可以促進(jìn)外周神經(jīng)再生、促進(jìn)受損的外周神經(jīng)功能指數(shù)恢復(fù)、促進(jìn)外周神經(jīng)橫斷部位電生理恢復(fù)、促進(jìn)外周神經(jīng)受損部位S-100蛋白和/或神經(jīng)絲蛋白表達(dá)、促進(jìn)外周神經(jīng)受損部位髓鞘直徑和/或髓鞘壁厚度增加、促進(jìn)靶器官的恢復(fù)?？梢姡摴δ懿牧显谖磥?lái)臨床外周神經(jīng)損傷修復(fù)的應(yīng)用具有更為重要的現(xiàn)實(shí)指導(dǎo)意義。
【IPC分類】A61L27/54, A61L27/24
【公開號(hào)】CN105561390
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410553525
【發(fā)明人】戴建武, 趙燕南, 肖志峰, 陳冰
【申請(qǐng)人】中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所
【公開日】2016年5月11日
【申請(qǐng)日】2014年10月17日