用于制備化學(xué)品的無細(xì)胞最小化代謝反應(yīng)級聯(lián)的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及用于由碳源制備化學(xué)品的酶促方法。具體而言，公開了一種用于制備 目標(biāo)化學(xué)品的方法，其使用將糖源轉(zhuǎn)化為中間產(chǎn)物丙酮酸并接著將中間產(chǎn)物丙酮酸轉(zhuǎn)化為 目標(biāo)化學(xué)品的無細(xì)胞酶系統(tǒng)。
【背景技術(shù)】
[0002] 可持續(xù)且基于生物質(zhì)的制備策略的發(fā)展需要有效解聚為中間產(chǎn)物糖類，并且需要 將這些中間產(chǎn)物糖類轉(zhuǎn)化為化學(xué)產(chǎn)物的靈活且有效的技術(shù)。當(dāng)前，用于將生物質(zhì)轉(zhuǎn)化為化 學(xué)品的生物技術(shù)途徑聚焦于已良好建立的微生物發(fā)酵過程。
[0003] 然而，這些發(fā)酵途徑仍局限于細(xì)胞制備系統(tǒng)的生理限度。成本有效的發(fā)酵過程的 主要障礙在于它們的低溫度和溶劑耐受度，其引起較低的轉(zhuǎn)化效率和收率。此外，許多細(xì)胞 代謝通路經(jīng)常將底物非意向地再定向至非生產(chǎn)性通路。盡管在基因工程方面有所進(jìn)步，使 這些用于最優(yōu)產(chǎn)物形成的代謝網(wǎng)絡(luò)在有機(jī)體水平上精簡化（streamline)需耗費(fèi)時(shí)日，并 且由于高度的復(fù)雜性其仍然難以預(yù)測。
[0004] 較為突出的實(shí)例是在大腸桿菌（E. coli)中異丁醇的重組發(fā)酵制備。1~2% (v/V)異丁醇的滴定度已經(jīng)在微生物制備宿主中誘發(fā)毒性作用，從而引起較低的產(chǎn)物收率 (Nature 2008, 451，86-89)。此外，解聚的生物質(zhì)經(jīng)常包含限制微生物生長和產(chǎn)物收率的抑 制性或不可發(fā)酵的成分。因而，期望策略能克服基于細(xì)胞的制備的這些局限性。
[0005] 早在1897年Eduard Buchner使用酵母細(xì)胞的裂解物將葡萄糖轉(zhuǎn)化為乙醇 時(shí)，即已展示了化學(xué)品的無細(xì)胞制備（Ber. Dtsch. Chem. Ges. 1901，34, 1523-1530)。之 后Welch und Scopes, 1985展示出乙醇的無細(xì)胞制備，然而該方法在技術(shù)上幫助不大 (J. Biotechnol. 1985, 2, 257-273)。該系統(tǒng)缺少特異性并在裂解液中包括酶的副反應(yīng)和不 需要的活性。
[0006] 已經(jīng)記載有大量使用分離的酶來制備化學(xué)品的技術(shù)方法。舉例來說，例如通過添 加葡萄糖和葡萄糖脫氫酶，在需要輔因子（NAD)再生的由酮向手性醇的制備中使用醇脫氫 酶。這些方法已經(jīng)被設(shè)計(jì)成制備高價(jià)值的化學(xué)品，但是不提供包括以高能量和碳效率將糖 類轉(zhuǎn)化為化學(xué)品的多重酶反應(yīng)的酶系統(tǒng)。
[0007] Zhang 等人（Biotechnology:Research, Technology and Applications ;2008)記 載了由葡萄糖向正丁醇的無細(xì)胞酶促轉(zhuǎn)化的想法。這個(gè)構(gòu)思包括最少18種酶、數(shù)種不同的 輔因子和輔酶（例如，ATP、ADP、NADH、NAD、鐵氧化還原蛋白和輔酶A)。此外，該假定的方 法引起ATP的凈產(chǎn)生（net-production)從而另外需要三磷酸腺苷酶（ATPase)除去ATP。 在實(shí)際條件下控制三磷酸腺苷酶添加的同時(shí)維持平衡的ATP水平很難實(shí)現(xiàn)。為控制平衡的 ATP循環(huán)，多余的ATP的水解必須通過使用高度毒性的砷酸鹽來非常仔細(xì)地調(diào)整或消除?？?而言之，所記載的方法會(huì)很昂貴、效率低且技術(shù)上不穩(wěn)定。
[0008] EP2204453公開了一種用于由葡萄糖轉(zhuǎn)化為乙醇、正丁醇和/或異丁醇的方法。
[0009] 因此，需要由糖類制備化學(xué)品，尤其是制備能夠得自于丙酮酸的化學(xué)品例如乙醇、 異丁醇和其他C4醇的成本有效的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明的主要目的是通過將添加成分的數(shù)量降至最低來提供穩(wěn)定且技術(shù)上靈活 的無細(xì)胞方法。本發(fā)明通過無細(xì)胞酶促系統(tǒng)，僅使用有限數(shù)量的酶和有限組的輔因子來解 決以上需求。作為解決方案，本發(fā)明消除了對細(xì)胞的需要。結(jié)果，細(xì)胞相關(guān)方法的局限例如 較高的過程溫度、極端的PH、以及底物或產(chǎn)物毒性得以避免。通過將酶活性限制于反應(yīng)級聯(lián) 所需的那些并且選擇具有充分反應(yīng)選擇性的酶，消除非所需的向其他可選反應(yīng)通路的底物 再定向。由于其降低的分子復(fù)雜度和對嚴(yán)苛的工業(yè)反應(yīng)條件的快速適應(yīng)性，所設(shè)計(jì)的生物 催化方法優(yōu)于它們的細(xì)胞對應(yīng)方法。
[0011] 因此，本發(fā)明涉及優(yōu)選地在不存在生產(chǎn)性活細(xì)胞的條件下通過酶促過程將碳源 (優(yōu)選為糖類）生物轉(zhuǎn)化為目標(biāo)化學(xué)品的方法。目標(biāo)化學(xué)品優(yōu)選為疏水性、親水性或作為中 間產(chǎn)物的化合物。
[0012] 具體而言，根據(jù)優(yōu)選的方面，本發(fā)明方法不引起ATP/ADP的凈產(chǎn)生，并且不涉及 ATP酶和/或砷酸鹽。本發(fā)明方法優(yōu)選地不涉及輔因子ATP/ADP和/或任何磷酸化反應(yīng)。
[0013] 根據(jù)另一優(yōu)選方面，本發(fā)明方法在工序中僅使用一種氧化還原輔因子。該輔因子 優(yōu)選地選自NAD/NADH、NADP/NADPH、FAD/FADH2。優(yōu)選地，NAD/NADH (即，氧化還原對NAD+和 NADH+H+)是方法中的唯一輔因子。
[0014] 根據(jù)另一優(yōu)選實(shí)施方式，本發(fā)明方法包括調(diào)整各個(gè)酶促催化反應(yīng)步驟的酶活性， 從而使得活性等于或大于任意在先酶促催化反應(yīng)步驟的活性。
[0015] 根據(jù)另一優(yōu)選方面，本發(fā)明方法使用人工的最小化的反應(yīng)級聯(lián)，優(yōu)選僅需要一種 單一輔因子。作為本發(fā)明的結(jié)果，實(shí)現(xiàn)了由糖類無細(xì)胞地制備目標(biāo)化學(xué)品，特別是制備丙酮 酸。丙酮酸能夠進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為其他化學(xué)品，例如乙醇和異丁醇。本發(fā)明也包括在微生物生 產(chǎn)停止的條件下起作用的精簡化的級聯(lián)反應(yīng)。本發(fā)明可擴(kuò)展至許多工業(yè)上相關(guān)的分子。溶 劑耐受的生物催化劑的應(yīng)用使得可以得到高產(chǎn)物收率，其顯著地使下游產(chǎn)物回收簡化。
[0016] 根據(jù)另一優(yōu)選方面，本發(fā)明僅使用能耐受存在致失活的所制備化學(xué)品的酶。
[0017] 根據(jù)一個(gè)方面，本發(fā)明關(guān)注用于制備乙醇的方法，且在方法中采用的所有酶耐受 2% (w/w)、優(yōu)選為4% (w/w)、更優(yōu)選為6% (w/w)、更優(yōu)選為8% (w/w)、更優(yōu)選為10% (w/ w)、更優(yōu)選為12% (w/w)、還更優(yōu)選為14% (w/w)濃度的產(chǎn)物。
[0018] 根據(jù)另一方面，本發(fā)明關(guān)注用于制備異丁醇的方法，且在方法中采用的所有酶耐 受2% (w/w)、優(yōu)選為4% (w/w)、更優(yōu)選為6% (w/w)、更優(yōu)選為8% (w/w)、更優(yōu)選為10% (w/w)、更優(yōu)選為12% (w/w)、還更優(yōu)選為14% (w/w)濃度的產(chǎn)物。
[0019] 根據(jù)一個(gè)方面，本發(fā)明關(guān)注通過無細(xì)胞酶系統(tǒng)由葡萄糖和/或半乳糖、或含有葡 萄糖和/或半乳糖的二聚體、寡聚體或多聚體制備目標(biāo)化學(xué)品的方法，包括將葡萄糖轉(zhuǎn)化 為作為中間產(chǎn)物的丙酮酸；其中，不發(fā)生ATP的凈產(chǎn)生，優(yōu)選地其中不發(fā)生磷酸化反應(yīng)；且 其中葡萄糖向丙酮酸的轉(zhuǎn)化由選自脫氫酶、脫水酶和醛縮酶所組成的組的三種、四種或五 種酶的使用構(gòu)成，其中一種或多種酶選自各個(gè)組。優(yōu)選地，通過三種或四種酶，最優(yōu)選通過 四種酶實(shí)現(xiàn)由葡萄糖向丙酮酸的轉(zhuǎn)化。更優(yōu)選地，對于葡萄糖向丙酮酸的轉(zhuǎn)化，該方法包括 僅一種氧化還原輔因子的使用，且優(yōu)選地，需要此輔因子的那些酶中的一種或多種被優(yōu)化 為，與各個(gè)非優(yōu)化酶或野生型酶相比對該輔因子具有更大的活性。更優(yōu)選地，這樣的氧化還 原輔因子為NAD/NADH，且一種或多種酶被優(yōu)化為與各個(gè)非優(yōu)化酶或野生型酶相比對NAD/ NADH具有更大的活性。
[0020] 丙酮酸是主要的中間產(chǎn)物，像乙醇或異丁醇的分子能夠由丙酮酸以少量額外 酶促步驟而制備得到。新的無細(xì)胞工程方法使得可以制備丙酮酸或者得自丙酮酸的目 標(biāo)化學(xué)品。在禁止任何基于細(xì)胞的微生物等同物的反應(yīng)條件下，能夠得自丙酮酸的具 體目標(biāo)化學(xué)品為乙醇、正丁醇、2-丁醇和異丁醇。由于反應(yīng)級聯(lián)被設(shè)計(jì)為工具箱式系統(tǒng) (toolbox-system)，其他產(chǎn)物也作為目標(biāo)化合物。
[0021] 一般而言，優(yōu)選來自嗜熱生物的熱穩(wěn)定酶，因?yàn)樗鼈儍A向于耐受更高的過程溫度 和更高的溶劑濃度。因此，增強(qiáng)的熱穩(wěn)定性允許得到增加的反應(yīng)速率、底物擴(kuò)散、更低的 粘度、更好的相分離和降低的對反應(yīng)介質(zhì)的細(xì)菌污染。因?yàn)閷Φ孜镞x擇性的需求在不同反 應(yīng)階段變化，因此必須選擇酶的保真性。例如，在葡萄糖向關(guān)鍵的中間產(chǎn)物丙酮酸的轉(zhuǎn)化 中，DHAD(二羥酸脫水酶）混雜使得可以進(jìn)行葡糖酸和甘油酸的平行轉(zhuǎn)化（圖2)。相對于 DHAD，選擇ALDH (醛脫氫酶），其對于甘油醛具有特異性而不接受其他醛類例如作為下游反 應(yīng)中間產(chǎn)物的乙醛或異丁醛。這些先決條件通過能夠以優(yōu)異的選擇性僅將D-甘油醛轉(zhuǎn)化 為D-甘油酸的醛脫氫酶來滿足。因此，根據(jù)另一優(yōu)選方面，本發(fā)明方法能夠在高溫進(jìn)行較 長時(shí)間段，例如在40 °C~80 °C的溫度范圍進(jìn)行至少30分鐘，優(yōu)選為45 °C~70 °C，更優(yōu)選為 50 °C~60 °C，最優(yōu)選為50 °C或高于50 °C。在特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明方法采用不接 受乙醛和異丁醛作為底物的ALDH。
[0022] 為將反應(yīng)復(fù)雜度降至最低，設(shè)計(jì)的通路還可以加強(qiáng)成使用輔酶NADH作為僅有的 電子載體。條件是隨后的反應(yīng)保持氧化還原-中性，丙酮酸可以轉(zhuǎn)化為一系列工業(yè)平臺(tái)化 學(xué)品而不用持續(xù)添加任何電子穿梭體。
[0023] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，也可以使用工程酶，例如具有對于NADH的更大活性的 ALDH變體，例如得自于定向進(jìn)化法。這些對特定輔因子（例如NADH)反映出更大活性的優(yōu) 化酶，能夠在葡萄糖向丙酮酸的轉(zhuǎn)化過程中與最小化用量的酶（例如，使用三種或四種或 五種用于葡萄糖向丙酮酸轉(zhuǎn)化的酶）組合應(yīng)用，使得加強(qiáng)用于葡萄糖向丙酮酸轉(zhuǎn)化以及用 于碳源向目標(biāo)有機(jī)化合物總體轉(zhuǎn)化的酶利用以及進(jìn)一步改善的效率和生產(chǎn)率。
[0024] 各個(gè)酶的分子優(yōu)化使得可以迭代改善和擴(kuò)展所呈現(xiàn)的無細(xì)胞制備系統(tǒng)，特別注重 于活性、熱穩(wěn)定性和溶劑耐受性。此外，當(dāng)水解的木質(zhì)纖維素生物質(zhì)被用作原料時(shí)存在、并 且對基于細(xì)胞的方法有害的抑制劑抗性能夠通過酶工程而解決。
[0025] 關(guān)于本發(fā)明，且由本發(fā)明所反映出的，無細(xì)胞系統(tǒng)的穩(wěn)定性和降至最低的復(fù)雜性 消除了當(dāng)前基于細(xì)胞的制備的障礙，基于細(xì)胞的制備限制了生物類平臺(tái)化學(xué)品的更寬泛的 工業(yè)利用。丙酮酸是主要的中間產(chǎn)物，其可以作為其他商品化合物的無細(xì)胞生物合成的起 點(diǎn)。此處示出的酶促方式在酶和所需的輔酶的數(shù)量方面最小化，并用作為高效的且成本有 效的生物制備系統(tǒng)。
【附圖說明】
[0026] 圖1是經(jīng)由最小化的反應(yīng)級聯(lián)的乙醇和異丁醇無細(xì)胞反應(yīng)通路的示意圖。在反應(yīng) 的第一部分（頂部框），葡萄糖轉(zhuǎn)化為兩分子丙酮酸。取決于所期望的終產(chǎn)物和所應(yīng)用的 酶，丙酮酸可以在反應(yīng)級聯(lián)的第二部分導(dǎo)向乙醇（右下框）或異丁醇合成（左下框）。為清 楚起見，未示出反應(yīng)中獲得或釋放的質(zhì)子和〇)2和H2O分子。
[0027] 圖2 :乙醇的無細(xì)胞合成。a :中間產(chǎn)物濃度>5mM ;實(shí)心圈：葡萄糖濃度；空心圈：葡 糖酸濃度；實(shí)心三角：乙醇。b :中間產(chǎn)物濃度<5mM ;實(shí)心圈、虛線：KDG ;空心圈、虛線：丙酮 酸；實(shí)心三角、虛線：甘油酸；空心三角、虛線：乙醛。（注意葡萄糖、葡糖酸和KDG的濃度二 倍化以與乙醇濃度進(jìn)行更好比較（1摩爾葡萄糖轉(zhuǎn)化為2摩爾乙醇）。所有數(shù)據(jù)點(diǎn)表示來自 三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值。）
[0028] 圖3 :異丁醇的無細(xì)胞合成。a :中間產(chǎn)物濃度>2mM ;實(shí)心圈：葡萄糖濃度；空心圈： 葡糖酸濃度；實(shí)心三角：異丁醇。b :中間產(chǎn)物濃度<2mM ;實(shí)心圈、虛線：KDG ;點(diǎn)、虛線：丙酮 酸；實(shí)心三角、虛線：甘油酸；空心方塊、虛線：異丁醛；空心圈、虛線：KIV。DHIV完全無法檢 測。所有數(shù)據(jù)點(diǎn)表示來自三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值。
[0029] 圖4 :在不同異丁醇濃度的乙醇制備。實(shí)心菱形、直線：0%異丁醇；空心菱形、點(diǎn) 線：2%異丁醇；實(shí)心菱形、虛線：4%異丁醇；空心菱形、虛點(diǎn)線：6%異丁醇。b :針對異丁醇 濃度作圖的乙醇制備速率（mM/h)。
【具體實(shí)施方式】
[0030] 本發(fā)明關(guān)注一種通過無細(xì)胞酶系統(tǒng)由葡萄糖、半乳糖或葡萄糖與半乳糖的混合 物、或者含有葡萄糖的寡聚體或多聚體和/或含有半乳糖的寡聚體或多聚體制備目標(biāo)有機(jī) 化合物的方法，其包括葡萄糖和/或半乳糖向作為中間產(chǎn)物的丙酮酸的轉(zhuǎn)化；其中該方法 包括以下步驟：
[0031] (1)將葡萄糖和/或半乳糖氧化為葡糖酸和/或半乳糖酸；
[0032] (2)將葡糖酸和/或半乳糖酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸和甘油醛；
[0033] (3)將甘油醛氧化為甘油酸；
[0034] (4)將甘油酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸；
[0035] (5)將步驟⑵