或半乳糖作為底物以及接受甘油醛作為底物的葡萄糖脫氫酶（EC I. 1. 1.47)，或
[0121] ?接受葡萄糖或半乳糖作為底物以及接受甘油醛作為底物的醛脫氫酶（EC 1. 2. 1. 3)
[0122] 本文記載的酶數量減少的一種或多種優(yōu)化為具有更高輔因子活性的酶的組合使 用帶來進一步改善的用于葡萄糖向丙酮酸的轉化方法，且因而最終帶來進一步改善的用于 制備目標化學品的方法。
[0123] 根據本發(fā)明的優(yōu)選方面，葡萄糖向丙酮酸的轉化包括使用一種或多種與各個非優(yōu) 化酶相比針對更高的輔因子活性而優(yōu)化的酶，優(yōu)選針對更高的NADH活性。更高的輔因子活 性包括，例如，酶對作為底物的輔因子的改善的接受度。與各個非優(yōu)化酶相比針對更高輔因 子活性、優(yōu)選為針對更高的NADH活性而優(yōu)化的酶為，已經被改造為得到更高輔因子活性、 優(yōu)選為更高NADH活性的非優(yōu)化酶變體的酶。優(yōu)化的一個實例是使用定向進化法（directed evolution approach)。得到更高輔因子活性、優(yōu)選為更高NADH活性的非優(yōu)化酶變體為由 這樣的核苷酸序列所編碼的酶，所述核苷酸序列包含與編碼非優(yōu)化酶（即，比較性酶）的核 苷酸序列不同的至少一個核苷酸，或者得到更高輔因子活性、優(yōu)選為更高NADH活性的非優(yōu) 化酶變體為這樣的酶，其包含與非優(yōu)化酶（即，比較性酶）的氨基酸序列不同的至少一個氨 基酸。非優(yōu)化酶可以是野生型酶。SEQ ID NO. 8為作為非優(yōu)化酶的野生型酶的優(yōu)選實例。 另一實例為SEQ ID NO. 2的酶。
[0124] 改善的輔因子活性可以以絕對量測定，或者可選地以相對量測定。例如，可以使用 酶的純化形式的比活。在該情況中，在本發(fā)明中，定義優(yōu)化酶的對于特定輔因子的改善活 性是指，在〇. 2ml的總反應體積中，作為底物的甘油醛/甘油酸鹽為ImM且特定輔因子為 2mM時，酶在50°C和pH 7.0對該輔因子具有0.4U/mg或更高的比活。優(yōu)選的輔因子為NAD/ NADH。在這些條件下，比活的優(yōu)選實施方式為0. 6U/mg或更高，優(yōu)選為0. 8U/mg或更高，更 優(yōu)選為I. 〇U/mg或更高，最優(yōu)選為I. 2U/mg或更高，最高度優(yōu)選I. 5U/mg或更高。更加優(yōu)選 的實施方式為其中上述提及的比活在3%異丁醇的存在下測定?；蛘?，比活相對于比較性野 生型（例如，非優(yōu)化酶）而測定并標準化，并且定義優(yōu)化酶的改善活性為比野生型的值高2 倍或更多，優(yōu)選為高4倍或更多，再更優(yōu)選為高8倍或更多，最優(yōu)選為高16倍或更多，最高 度優(yōu)選為高32倍或更多。
[0125] 或者，相對值可以使用標準操作指南而做出并相對于野生型的值進行標準化。例 如，包含酶變體（例如，脫氫酶變體；Ta-ALDH)庫的細胞菌落（例如大腸桿菌）被誘導、生 長、收獲、裂解，除去不溶的細胞碎片，且包含變體的上清液可以在標準條件下（例如，在 50°C的50mM HEPES(pH 7)中，2mM NAD，lmM D-甘油醛）測試相對活性。在給定時間（例 如，20min)之后，輔因子形成（例如NADH形成）能夠以分光光度法檢測，且相對于野生型較 佳的輔因子（例如NADH形成）能夠被檢測并提供為相對于所研宄變體的野生型的改善的 相對活性。具體而言，定義優(yōu)化酶的改善的活性為比野生型的值高2倍或更多，優(yōu)選為高4 倍或更多，再更優(yōu)選為高8倍或更多，最優(yōu)選為高16倍或更多，最高度優(yōu)選為高32倍或更 多。
[0126] 得到更高的輔因子活性、優(yōu)選為更高的NADH活性的優(yōu)化酶可以由這樣的核苷酸 序列編碼，該核苷酸序列包含對于編碼非優(yōu)化酶的核苷酸序列的替換、增加或缺失，其中替 換、增加或缺失包括1~60個核苷酸，優(yōu)選為1~21個核苷酸，更優(yōu)選為1~9個核苷酸， 特別優(yōu)選為1~3個核苷酸，最特別優(yōu)選為1個核苷酸。得到具備更高輔因子活性、優(yōu)選為 更高NADH活性的優(yōu)化酶的對編碼非優(yōu)化酶的核苷酸序列的替換、增加或缺失可以定義為， 得到與非優(yōu)化酶的80%核苷酸序列同一性，優(yōu)選為90%核苷酸序列同一性，更優(yōu)選為95% 核苷酸序列同一1性，最優(yōu)選為97 %核苷酸序列同一"性，最高度優(yōu)選為99 %核苷酸序列同一 性。非優(yōu)化酶可以是野生型酶。SEQ ID NO. 8為作為非優(yōu)化酶的野生型酶的優(yōu)選實例。另 一實例為SEQ ID NO. 2的酶。
[0127] 序列同一性的比較（比對）使用ClustalW算法進行（Larkin M. A.，Blackshields G. , Brown N. P. , Chenna R. , McGettigan P. A. , Mcffilliam Η. , Valentin F. , Wallace Ι.Μ. ,ffilm A. , Lopez R. , Thompson J. D. , Gibson Τ. J. and Higgins D. G. (2007) Clustalff and ClustalX version 2. Bioinformatics2007 23 (21):2947-2948)〇
[0128] 相似地，得到更高的輔因子活性、優(yōu)選為更高的NADH活性的優(yōu)化酶可以是這樣的 氨基酸序列，其包含對非優(yōu)化酶的氨基酸序列的替換、增加或缺失，其中在替換、增加或缺 失中包括1~20個氨基酸，優(yōu)選為1~10個氨基酸，更優(yōu)選為1~5個氨基酸，特別優(yōu)選 為1~3個氨基酸，最特別優(yōu)選為1個氨基酸。得到具有更高輔因子活性、優(yōu)選為更高NADH 活性的優(yōu)化酶的對于非優(yōu)化酶氨基酸序列的替換、增加或缺失可以定義為，得到與非優(yōu)化 酶的80%氨基酸序列同一性，優(yōu)選為90%氨基酸序列同一性，更優(yōu)選為95%氨基酸序列同 一"性，最優(yōu)選為97 %氨基酸序列同一"性，最高度優(yōu)選為99 %氨基酸序列同一"性。非優(yōu)化酶 可以是野生型酶。SEQ ID NO. 8為作為非優(yōu)化酶的野生型酶的優(yōu)選實例。另一實例為SEQ ID NO. 2 的酶。
[0129] 本發(fā)明的高度優(yōu)選的實施方式為，得到更高的輔因子活性、優(yōu)選為更高的NADH活 性的優(yōu)化酶為這樣的氨基酸序列，其與非優(yōu)化酶相比在氨基酸序列中包含1~10個突變、 優(yōu)選為1~8個突變、更優(yōu)選為1~5個突變、更高度優(yōu)選為1~3個突變、最優(yōu)選為1~2 個突變、最高度優(yōu)選為1個突變。突變被認為是與非優(yōu)化酶相比與同一氨基酸不對應的氨 基酸。非優(yōu)化酶可以是野生型酶。SEQ ID NO. 8為作為非優(yōu)化酶的野生型酶的優(yōu)選實例。 另一實例為SEQ ID NO. 2的酶。
[0130] 相似地，本發(fā)明包括：在SEQ ID N0:56中反映出的編碼具有突變F34L的優(yōu)化醛脫 氫酶的核苷酸序列以及SEQ ID NO: 57中反映出的對于具有突變F34L的優(yōu)化醛脫氫酶的氨 基酸序列；在SEQ ID NO: 58中反映出的編碼具有突變S405C的優(yōu)化醛脫氫酶的核苷酸序列 以及SEQ ID N0:59中反映出的對于具有突變S405C的優(yōu)化醛脫氫酶的氨基酸序列；在SEQ ID NO:60中反映出的編碼具有突變F34L和突變S405C的優(yōu)化醛脫氫酶的核苷酸序列以及 SEQ ID N0:61中反映出的對于具有突變F34L和突變S405C的優(yōu)化醛脫氫酶的氨基酸序列； 在SEQ ID NO:62中反映出的編碼具有突變F34M和突變S405N的優(yōu)化醛脫氫酶的核苷酸序 列以及SEQ ID N0:63中反映出的對于具有突變F34M和突變S405N的優(yōu)化醛脫氫酶的氨基 酸序列；在SEQ ID N0:64中反映出的編碼具有突變W271S的優(yōu)化醛脫氫酶的核苷酸序列以 及SEQ ID NO: 65中反映出的對于具有突變W271S的優(yōu)化醛脫氫酶的氨基酸序列；在SEQ ID N0:9中反映出的編碼具有突變F34M和突變Y399C以及突變S405N的優(yōu)化醛脫氫酶的核苷 酸序列以及SEQ ID N0:10中反映出的對于具有突變F34M和突變Y399C以及突變S405N的 優(yōu)化醛脫氫酶的氨基酸序列；在SEQ ID N0:66中反映出的編碼具有突變Y399R的優(yōu)化醛脫 氫酶的核苷酸序列以及SEQ ID N0:67中反映出的對于具有突變Y399R的優(yōu)化醛脫氫酶的 氨基酸序列；在SEQ ID N0:68中反映出的編碼具有突變F34M和突變W271S以及突變Y399C 和突變S405N的優(yōu)化醛脫氫酶的核苷酸序列以及SEQ ID NO:69中反映出的對于具有突變 F34M和突變W271S以及突變Y399C和突變S405N的優(yōu)化醛脫氫酶的氨基酸序列。與這些特 定實施方式相關的示例性技術效果包括在表3中。
[0131] 作為優(yōu)選實施方式，SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:8可以被認為是分別對于葡糖脫 氫酶和醛脫氫酶的野生型酶的代表。SEQ ID N0:8是用作比較性序列以識別是否存在對于 輔因子特別是NAD/NADH的改善活性的優(yōu)選序列。
[0132] 作為優(yōu)選實施方式，SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:8可以被認為是分別對于葡糖脫 氫酶和醛脫氫酶的非優(yōu)化酶的代表。SEQ ID N0:8是用作比較性序列以識別是否存在對于 輔因子特別是NAD/NADH的改善活性的優(yōu)選序列。
[0133] 作為優(yōu)選實施方式，由SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO:7的核苷酸序列編碼的蛋白序 列可以被認為是分別對于葡糖脫氫酶和醛脫氫酶的野生型酶的代表。SEQ ID N0:7是編碼 用作比較性序列以識別是否存在對于輔因子特別是NAD/NADH的改善活性的蛋白序列的優(yōu) 選核苷酸序列。
[0134] 作為優(yōu)選實施方式，由SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO:7的核苷酸序列編碼的蛋白序 列可以被認為是分別對于葡糖脫氫酶和醛脫氫酶的非優(yōu)化酶的代表。SEQ ID N0:7是編碼 用作比較性序列以識別是否存在對于輔因子特別是NAD/NADH的改善活性的蛋白序列的優(yōu) 選核苷酸序列。
[0135] 本發(fā)明包括上述優(yōu)化酶本身以及該優(yōu)化酶在葡萄糖向丙酮酸轉化中的用途以及 所描述的用于制備目標化學品的方法。例如，將一種或多種優(yōu)化酶用在通過無細胞酶系統 由葡萄糖和/或半乳糖，或者含有葡萄糖和/或半乳糖的二聚體、寡聚體或多聚體制備目標 化學品的方法中，該方法包括葡萄糖向作為中間產物的丙酮酸的轉化；其中不發(fā)生ATP的 凈產生，并且優(yōu)選地其中不發(fā)生磷酸化反應；而且其中葡萄糖向丙酮酸的轉化由選自脫氫 酶、脫水酶和醛縮酶所組成的組的三種、四種或五種酶的使用構成，其中一種或多種酶選自 各個組。優(yōu)選地，從葡萄糖向丙酮酸的轉化通過三種或四種酶實現，最優(yōu)選通過四種酶實 現。
[0136] 方法條件的選擇：
[0137] 根據本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，葡萄糖向作為中間產物的丙酮酸的轉化由一摩爾葡 萄糖向兩摩爾丙酮酸的轉化構成。
[0138] 根據本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方式且如本文進一步所述的，制備方法在包含兩個分 離相的液體體系中進行，且目標化學品主要存在于其中一個分離相中或形成其中一個分離 相，并且從該分離相中收集目標化學品。根據本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方式且如本文進一步 所述的，添加有機溶劑來建立兩個分離相。
[0139] 根據本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方式且如本文進一步所述的，將碳源化合物持續(xù)供應 到工序中且不斷地移出目標化學品（分批補料法）。
[0140] 根據一個優(yōu)選的方面，本發(fā)明的制備方法包括以下4個步驟：
[0141] 步驟I :使用微生物細胞制備用于碳源向化學品（本文中也稱為"目標化學品"或 "目標有機化合物"）轉化的酶（"目標酶；
[0142] 步驟II :從步驟I使用的微生物細胞釋放目標酶，優(yōu)選與輔因子的釋放以及和其 他非目標酶活性的失活相結合；或從非目標酶活性中純化目標酶，優(yōu)選地與輔因子的釋放 相結合；
[0143] 步驟III :在適合于碳源向目標化學品轉化的條件下，使步驟II的目標酶與碳源 接觸；
[0144] 步驟IV :從反應混合物分離目標化學品。
[0145] 酶選擇和制備：
[0146] 在步驟I中，目標酶使用微生物細胞制備。在本發(fā)明的一個實施方式中，酶制備在 兩種以上的不同微生物細胞系中完成，從而整個制備路徑或其主要部分不在一種微生物中 重新構建。這避免起始不想要的底物向化學品的轉化，并引起更加有效率的酶制備。酶制 備可以為細胞內或細胞外的，重組體或非重組體。如果酶制備為重組體，則其可以為同源或 異源。
[0147] 在本發(fā)明的另一實施方式中，目標酶對一種底物和一種反應有選擇性。優(yōu)選地，目 標酶具有與任何其他天然存在的底物相比為至少10倍的底物選擇性（