kcat/kM)以及至少 90 %的反應(yīng)選擇性。更優(yōu)選地，目標酶具有至少20倍的底物選擇性和至少95 %的反應(yīng)選擇 性。再更優(yōu)選地，目標酶具有至少100倍的底物選擇性和至少99%的反應(yīng)選擇性。
[0148] 在本發(fā)明的另一個實施方式中，目標酶表現(xiàn)出不受多步反應(yīng)的底物或產(chǎn)物或其它 中間產(chǎn)物的抑制作用或抑制作用低（無或低反饋抑制）。優(yōu)選多步反應(yīng)的任意底物、產(chǎn)物 或中間產(chǎn)物的抑制常數(shù)（K i)為至少10倍高于各酶和底物的Km值。更優(yōu)選該抑制常數(shù)100 倍高于各KM。在另一個特別優(yōu)選的實施方式中，目標酶在多步反應(yīng)的任意底物、中間產(chǎn)物或 產(chǎn)物的濃度為IOOmM或更高的條件下仍具有其最大活性的50%。
[0149] 優(yōu)選目標酶具有調(diào)整適應(yīng)于酶促路線的多步性質(zhì)的1(_和Km值。
[0150] 根據(jù)本發(fā)明方法的一個實施方式，所述目標酶耐受水平提高的目標化學品，并任 選地耐受任選添加以促進目標化學品分離到分離相中的其它有機溶劑。優(yōu)選地，目標酶耐 受高于2% (w/w)、更優(yōu)選為高于4% (w/w)、更優(yōu)選為高于6% (w/w)、再更優(yōu)選更優(yōu)選高于 8% (w/w)濃度的目標化學品。在特別優(yōu)選的實施方式中，目標酶耐受高達水中最大溶解度 的濃度的目標化學品。
[0151] 在優(yōu)選實施方式中，整個無細胞酶系統(tǒng)耐受升高水平的目標化學品，例如異丁醇、 丁醇或乙醇。在特別優(yōu)選的實施方式中，整個無細胞酶系統(tǒng)耐受濃度為2% (w/w)或更高、 優(yōu)選為4 % (w/w)或更高、更優(yōu)選為6 % (w/w)或更高、再更優(yōu)選為8 % (w/w)或更高的異丁 醇。在特別優(yōu)選的實施方式中，整個無細胞酶系統(tǒng)耐受相分離發(fā)生時的濃度（即，在工序溫 度下與目標化學品在水中的最大溶解度對應(yīng)的濃度）的目標化學品例如異丁醇。
[0152] 在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，目標酶耐受升高水平的離液序列高的（chaotropic) 物質(zhì)和升高的溫度。優(yōu)選地，目標酶耐受濃度高于1M、更優(yōu)選為高于3M、且最優(yōu)選為高于6M 的鹽酸胍。另外可選地或相結(jié)合地，目標酶耐受優(yōu)選高于40~90°C的溫度，更優(yōu)選為高于 50~80°C，且最優(yōu)選高于50~60°C。在這些優(yōu)選實施方式中，目標酶的制備在宿主微生物 中完成，宿主微生物的內(nèi)源酶活性大致在升高水平的離液序列高的物質(zhì)和/或升高溫度下 失活。
[0153] 優(yōu)選地，目標酶的制備使用一種或多種以下微生物種類進行：大腸桿菌；熒光假 單胞菌（Pseudomonas fluorescence);枯草芽抱桿菌（Bacillus subtilis);釀酒酵母；巴 斯德畢赤酵母（Pichia pastoris);多形漢遜酵母（Hansenula polymorpha);乳酸克魯維 酵母（Klyuveromyces Iactis);里氏木霉（Trichoderma reesei);黑曲霉（Aspergillus niger)。更加優(yōu)選地，目標酶的制備實用大腸桿菌作為宿主生物來進行。優(yōu)選地，酶的制備 和細胞生長分到不同生長階段中。由此，沒有底物用于一般代謝活動。
[0154] 在本發(fā)明的優(yōu)選方面，將大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、釀酒酵母和/或巴斯德畢赤酵 母用作表達宿主，且一種或多種酶在各個單獨菌株中重組制備。在另一優(yōu)選方面，大腸桿 菌是表達宿主且每種單獨菌株表達一種酶。優(yōu)選地，這些酶在孵育至少lOmin、優(yōu)選為至少 30min時使表達宿主失活（即，細胞生長）并使源自表達宿主且接受糖源（例如，葡萄糖或 半乳糖）到目標化學品的任何中間產(chǎn)物作為底物的酶活性的至少90%、優(yōu)選為95%、更優(yōu) 選為99%失活的溫度和/或pH值下具有長于12小時的半衰期。在特別優(yōu)選的方面，在這 樣的溫度下孵育30min后檢測不到這些酶活性。最優(yōu)選地，表達的酶在中性pH的標準緩沖 液中于50°C孵育時具有至少12小時的半衰期。
[0155] 在本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方式中，目標酶耐受升高水平的氧。優(yōu)選地，目標酶耐受 高于lppm、更優(yōu)選高于7ppm的氧濃度。最優(yōu)選地，目標酶在有氧條件下有活性且穩(wěn)定。優(yōu) 選地，多步驟反應(yīng)不需要氧且不被氧所抑制。由此，不必要進行排除氧的特殊預防措施，使 得工序更加穩(wěn)定而在制備環(huán)境和/或儀器方面需要較少精力。
[0156] 在步驟II中，目標酶從細胞中釋放。在優(yōu)選的實施方式中，目標酶耐受高溫和離 液序列高的條件，而來自生產(chǎn)微生物的背景酶不耐受這些條件。根據(jù)該實施方式，目標酶在 微生物細胞中于細胞內(nèi)制備，使用高溫和/或離液序列高的條件使細胞裂解，由此釋放活 化形式的目標酶，任選地與輔因子一起，并使得不想要的背景酶活性失活。
[0157] 在另一優(yōu)選的實施方式中，酶制備是胞外的，目標酶耐受高溫和離液序列高的條 件，且背景酶活性（非目標酶）不耐受這些條件。根據(jù)該實施方式，來自細胞外制備的上清 液在條件例如高溫和/或離液序列高的條件下處理。這引起不想要的背景酶活性（非目標 酶）的失活，并且目標酶保持有活性。
[0158] 在本發(fā)明的一個實施方式中，一個或多個的多步驟酶促轉(zhuǎn)化步驟需要輔因子。在 本發(fā)明的一個方面，這些輔因子被添加到酶混合物中。在該實施方式的另一特別優(yōu)選的方 面，這些輔因子也通過微生物細胞在細胞內(nèi)制備并通過相同的處理進行釋放以釋放目標 酶。在本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方式中，微生物細胞被改造以優(yōu)化所產(chǎn)生的輔因子的水平。優(yōu) 選地，微生物細胞在步驟II過程中失活。由此，細胞生長和酶活性在工序中分開，且碳源不 被不期望的細胞生長所消耗。
[0159] 酶促轉(zhuǎn)化的工序設(shè)定（set-up):
[0160] 在步驟III中，碳源在多步驟酶促反應(yīng)中被酶混合物轉(zhuǎn)化為丙酮酸，且任選地進 一步轉(zhuǎn)化為目標化學品。根據(jù)本發(fā)明的方法，上述酶在目標化學品的變性作用下具有活性。 優(yōu)選地，步驟I中使用的微生物細胞在步驟III的反應(yīng)條件下是失活的和/或被失活。
[0161] 優(yōu)選地，目標酶混合物中各酶的濃度在工序條件下調(diào)整成優(yōu)化水平。在特別優(yōu)選 的實施方式中，將一種或多種酶的濃度提高到通常的細胞內(nèi)濃度以上，以提高該方法的產(chǎn) 量（不為傳統(tǒng)方法中微生物的最大密度所限）。在另一特別優(yōu)選的實施方式中，設(shè)計一種或 多種酶以達最大催化效率（相比傳統(tǒng)方法，導致更低的反應(yīng)器規(guī)模和運行成本）。
[0162] 將目標酶混合物中的酶的活性調(diào)整成工序條件下的優(yōu)化水平。在優(yōu)選實施方式 中，與級聯(lián)中稍后的酶的活性相比，將酶促級聯(lián)的第一酶的活性調(diào)整為更低的水平。這些酶 活性防止中間產(chǎn)物在反應(yīng)過程中積聚。如果酶用于多于一個的級聯(lián)步驟中，可以相應(yīng)地提 高活性。在特別優(yōu)選的實施方式中，酶促級聯(lián)的各個酶的活性調(diào)整為高于酶促級聯(lián)中任意 在先酶活性的水平。這些酶活性防止中間產(chǎn)物在反應(yīng)過程中積聚。
[0163] 在另一優(yōu)選實施方式中，目標化學品以在工序條件下能夠與水混合成單一相的最 大水平或稍高于該水平的濃度添加至步驟III的反應(yīng)混合物中或存在于該混合物中。根據(jù) 該實施方式，目標化學品在工序中不斷地分隔到第二相中。在此實施方式的一個具體變型 中，將水溶性物質(zhì)加到反應(yīng)混合物中，引起目標化學品在與沒有該添加物質(zhì)時的相分離濃 度相比更低的相分離濃度下相分離。這些物質(zhì)的實例為鹽并為本領(lǐng)域的技術(shù)人員公知。在 該實施方式的一個特別優(yōu)選的變型中，加入氯化鈉以降低目標化學品在水相中的溶解度
[0164] 在另一優(yōu)選的實施方式中，向工藝中加入額外的有機溶劑形成其自身的相并從水 相中提取出生產(chǎn)的疏水性化學品。此額外的溶劑的優(yōu)選實例包括正己烷、環(huán)己烷、辛醇、乙 酸乙酯、甲基丁基酮或其組合。
[0165] 在另一優(yōu)選實施方式中，由于通過采用對所需反應(yīng)特異的目標酶，副產(chǎn)物的形成 降低，產(chǎn)量提高。在另一優(yōu)選實施方式中，可催化副反應(yīng)的宿主酶在步驟II中被失活并/ 或在步驟III的反應(yīng)條件下失活。
[0166] 在本發(fā)明的又一優(yōu)選實施方式中，通過調(diào)節(jié)步驟III中對典型的微生物污染物有 毒的反應(yīng)條件避免工藝被微生物污染。這些條件包括升高的溫度、極端pH、添加有機化學 品。在本發(fā)明的特別優(yōu)選的實施方式中，目標化學品自身在工藝中達到的濃度條件下是有 毒的（更穩(wěn)定的工藝，對生產(chǎn)環(huán)境和/或設(shè)備用更少的精力）。
[0167] 根據(jù)本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方式，除由步驟I中使用的微生物產(chǎn)生的那些輔因子 以及步驟II所產(chǎn)生的細胞裂解物中所含的輔因子之外，不向反應(yīng)混合物添加額外的氧化 還原輔因子。這些輔因子的實例為FAD/FADH2、FMN/FMNH2、NAD/NADH、NADP/NADPH。根據(jù)該 實施方式，需要的輔因子由步驟I中的微生物細胞產(chǎn)生并在工序過程中再生（NADH到NAD 以及反之；NADPH到NADP以及反之）。在本發(fā)明的一個實施方式中，過量的還原當量（NADH、 NADPH)或能量當量（ATP)通過額外的酶（例如，用于NADH的NADH氧化酶；用于NADPH的 NADPH氧化酶）而再生。
[0168] 在本發(fā)明的特別優(yōu)選的實施方式中，在葡萄糖向丙酮酸的轉(zhuǎn)化中不涉及ATP或 ADP作為輔因子，且此轉(zhuǎn)化中包含的目標酶均不包括磷酸化步驟（無磷酸化的丙酮酸生 產(chǎn)）。
[0169] 在步驟IV中，從反應(yīng)混合物中分離出一種或多種目標化學品。在本發(fā)明的一個優(yōu) 選實施方式中，一種或多種目標化學品是疏水性的并形成分離相，其優(yōu)選包含所生產(chǎn)的化 學品的至少大部分。在一個特別優(yōu)選的實施方式中，一種或多種目標化學品連續(xù)不斷地從 反應(yīng)混合物中移出。
[0170] 在本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方式中，向待轉(zhuǎn)化成目標化學品的反應(yīng)混合物中連續(xù)添 加碳源。同樣地，目標化學品優(yōu)選以分離相連續(xù)不斷地移出并通過本領(lǐng)域已知的方法進一 步純化。由此，由于產(chǎn)物在可進一步純化的分離相中收集，產(chǎn)物分離簡化。由此，產(chǎn)量提高 且產(chǎn)物純化簡化。
[0171] 在另一優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的方法不需要ADP或ATP作為輔因子。其他方法 (Welch and Scopes, 1985 ;Algar and Scopes, 1985)需要輔因子例如ADP/ATP和NAD/NADH。 葡萄糖向丁醇的假定轉(zhuǎn)化（Zhang等人，2008)需要輔因子ADP/ATP、NAD/NADH、鐵氧化還原 蛋白和輔酶A。所記載的無細胞酶促方法（Zhang等人，2008，Welch and Scopes 1985)的主 要問題為ATP的積聚。在已知的方法中，不期望的ATP積聚通過添加ATP酶而克服。然而， 難以找到ATP酶的正確濃度，因為其取決于底物和不同中間產(chǎn)物的濃度以及酶的活性。在 太多ATP酶或太少ATP酶的情況下，引起ATP不平衡，且轉(zhuǎn)化完全停止（Welch and Scopes， 1985)。作為對ATP酶的替代物，也可以使用砷酸鹽，其具有與ATP酶相似的不利之處。與 此相對，根據(jù)特別優(yōu)選的方面，本發(fā)明的無細胞方法將碳源例如葡萄糖轉(zhuǎn)化為丙酮酸，且更 優(yōu)選地為葡萄糖到目標化學品，而沒有ATP的凈產(chǎn)生且不需要使用ATP酶和/或砷酸鹽。
[0172] 丙酮酸的制備
[0173] 關(guān)于由葡萄糖制備丙酮酸，在下文中描述若干優(yōu)選實施方式。一分子葡萄糖產(chǎn)生 兩分子丙酮酸。丙酮酸可以隨后被轉(zhuǎn)化為目標化學品例如正丁醇、異丁醇、乙醇和2-丁醇。
[0174] 根據(jù)本發(fā)明的一個方面，葡萄糖通過使用以下酶而轉(zhuǎn)化為丙酮酸：
[0175] 酶組合 P-I ：
【主權(quán)項】
1. 一種通過無細胞酶系統(tǒng)由葡萄糖、半乳糖、或葡萄糖與半乳糖的混合物、或含有葡萄 糖的寡聚體或多聚體、和/或含有半乳糖的寡聚體或多聚體制備目標有機化合物的方法， 包括將葡萄糖和/或半乳糖轉(zhuǎn)化為作為中間產(chǎn)物的丙酮酸；其中所述方法包括以下步驟： (1) 將葡萄糖和/或半乳糖氧化為葡糖酸和/或半乳糖酸； (2) 將葡糖酸和/或半乳糖酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸和甘油醛； (3) 將甘油醛氧化為甘油酸； (4) 將甘油酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸； (5) 將步驟⑵和⑷的丙酮酸轉(zhuǎn)化為目標化合物， 其中步驟（1)和（3)用一種或多種酶進行酶促催化且所述步驟涉及使用所述酶將添加 和/或存在的用于電子傳遞的單一輔因子還原；且其中步驟（5)包括涉及步驟（1)和（3) 的輔因子的還原形式的酶促催化反應(yīng)；且其中所述方法在至少40°C的溫度下進行至少30 分鐘的時間。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述方法的溫度保持在40~80°C的范圍內(nèi)，優(yōu)選 在45~70°C的范圍內(nèi)，更優(yōu)選在50~60°C的范圍內(nèi)，最優(yōu)選在50°C或高于50°C。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的方法，其中所述