和（4)中的丙酮酸轉(zhuǎn)化為目標化合物。
[0036] 其中，步驟（1)和（3)用一種或多種酶進行酶促催化，且該步驟涉及使用上述酶以 還原添加的和/或存在以用于電子傳遞的單一輔因子；且其中步驟（5)包括涉及步驟（1) 和（3)的輔因子還原形式的酶促催化反應(yīng)。
[0037] 該方法的優(yōu)選實施方式包括以下：
[0038] 本發(fā)明的方法，其中該方法在至少40 °C的溫度進行至少30分鐘。
[0039] 本發(fā)明的方法，其中該方法的溫度保持在40~80°C的范圍，優(yōu)選為45~70°C的 范圍，更優(yōu)選為50~60 °C的范圍，最優(yōu)選為50 °C或高于50 °C。
[0040] 本發(fā)明的方法，其中該方法保持在指定溫度至少30分鐘，優(yōu)選為至少3小時，更優(yōu) 選為至少12小時，再更優(yōu)選為至少24小時，最優(yōu)選為至少48小時，最高度優(yōu)選為至少72 小時。
[0041] 本發(fā)明的方法，其中該方法的步驟（1)包括單一脫氫酶的使用以將葡萄糖和/或 半乳糖氧化為葡糖酸和/或半乳糖酸。
[0042] 本發(fā)明的方法，其中步驟（1)通過單一酶催化。
[0043] 本發(fā)明的方法，其中步驟（1)包括脫氫酶的使用。
[0044] 本發(fā)明的方法，其中步驟（2)包括將葡糖酸轉(zhuǎn)化為2-酮-3-脫氧葡糖酸，以及將 2-酮-3-脫氧葡糖酸轉(zhuǎn)化為甘油醛和丙酮酸。
[0045] 本發(fā)明的方法，其中步驟（2)包括二羥酸脫水酶和酮-3-脫氧葡糖酸醛縮酶的使 用。
[0046] 本發(fā)明的方法，其中步驟（3)包括脫氫酶的使用以將甘油醛氧化為甘油酸。
[0047] 本發(fā)明的方法，其中步驟（1)和（3)使用單一脫氫酶進行。
[0048] 本發(fā)明的方法，其中不發(fā)生ATP的凈產(chǎn)生。
[0049] 本發(fā)明的方法，其中不添加 ATP酶或砷酸鹽。
[0050] 本發(fā)明的方法，其中不使用ATP和/或ADP作為輔因子來進行該方法。
[0051] 本發(fā)明的方法，其中單一輔因子選自NAD/NADH、NADP/NADPH、和FAD/FADH2。
[0052] 本發(fā)明的方法，其中單一輔因子為NAD/NADH。
[0053] 本發(fā)明的方法，其中葡萄糖為優(yōu)選的起始原料。
[0054] 本發(fā)明的方法，其中各個酶促催化反應(yīng)步驟的酶活性調(diào)整成等于或高于任何在先 酶促催化反應(yīng)步驟的活性。
[0055] 本發(fā)明的方法，其中使用甘油醛作為底物時的酶比活比使用乙醛或異丁醛作為底 物時的酶比活高出至少100倍，更優(yōu)選為高出至少500倍，再更優(yōu)選為高出至少800倍，最 優(yōu)選為高出至少1000倍。
[0056] 本發(fā)明的方法，由此
[0057] -對于葡萄糖和/或半乳糖向丙酮酸的轉(zhuǎn)化，僅使用選自脫氫酶、脫水酶和醛縮酶 所組成的組的酶；以及
[0058] -其中一種或多種上述酶選自各個組。
[0059] 優(yōu)選的脫氫酶、脫水酶和醛縮酶為，屬于EC I. I. 1. 47或EC 1. 2. 1. 3的脫氫酶、屬 于EC 4. 2. 1. 9或4. 2. 1. 39的脫水酶、和屬于EC 4. 1. 2. 14的醛縮酶。
[0060] 本發(fā)明的方法，其中葡萄糖和/或半乳糖向丙酮酸的轉(zhuǎn)化由一種或兩種脫氫酶、 一種或兩種脫水酶和一種醛縮酶的使用構(gòu)成。
[0061] 本發(fā)明的方法，其中葡萄糖和/或半乳糖向丙酮酸的轉(zhuǎn)化由兩種脫氫酶、一種脫 水酶和一種醛縮酶的使用構(gòu)成。
[0062] 本發(fā)明的方法，其中葡萄糖和/或半乳糖向丙酮酸的轉(zhuǎn)化由一種脫氫酶、一種脫 水酶和一種醛縮酶的使用構(gòu)成。
[0063] 本發(fā)明的方法，其中包含在任一表格P-1、P-2-a、P-2-b、P-2-c、P-2-d、P-3-a、 P-3-b和P-3-c中的酶組合中的一種被用于葡萄糖和/或半乳糖向丙酮酸的轉(zhuǎn)化。
[0064] 本發(fā)明的方法，其中用于葡萄糖和/或半乳糖向丙酮酸的轉(zhuǎn)化的酶選自：得 自硫磺礦硫化葉菌（Sulfolobus solfataricus)的葡糖脫氫酶⑶H(EC 1.1.1.47)， NP 344316. 1，Seq ID 02;得自硫磺礦硫化葉菌的二羥酸脫水酶DHAD(EC 4.2. 1.9)，NP 344419. 1，Seq ID 04 ;得自硫磺礦硫化葉菌的葡糖酸脫水酶（EC 4. 2. 1. 39)，NP_344505 ; 得自硫磺礦硫化葉菌的葡糖酸脫水酶（EC 4. 2. I. 39)，NP_344505,突變I9L ;得自氧化 木糖無色桿菌（Achromobacter xylsoxidans)的葡糖酸脫水酶 ilvEDD(EC 4.2.1.39); 得自勤奮生金球菌（Metallosphaera sedula)DSM 5348的葡糖酸脫水酶iIvEDD(EC 4.2.1.39);得自嗜酸熱原體（Thermoplasma acidophilum)DSM 1728的葡糖酸脫水酶 ilvEDD(EC 4. 2. I. 39);得自嗜酸熱原體DSM 1728 的葡糖酸脫水酶 ilvEDD(EC 4. 2. I. 39); 得自硫磺礦硫化葉菌的2-酮-3-脫氧葡糖酸醛縮酶KDGA(EC 4. 1. 2. 14)，NP344504. 1 ; 得自嗜酸熱硫化葉菌（Sulfolobus acidocaldaricus)的2-酮-3-脫氧葡糖酸醛縮酶 1(06六出0 4.1.2.14)，36110 06;得自卩1&￥<^&(^61'；[11111；1^^81(1;[1]1&1^8的酸脫氫酶六0)!1出〇 L 2. L 3)，BAB96577. 1 ;得自嗜酸熱原體的醛脫氫酶ALDH (EC L 2. L 3)，Seq ID 08 ;得自 嗜酸熱原體的醛脫氫酶八0)!1出(：1.2.1.3)，突變？341+￥3990+54051569 10 10;得自硫磺 礦硫化葉菌的甘油酸激酶（EC 2. 7. 1. )，NP_342180. 1 ;得自頭寇岱硫化葉菌（Sulfolobus tokodaii)的甘油酸2-激酶（EC 2. 7. L 165)，Uniprot Q96YZ3. 1 ;得自硫磺礦硫化葉菌的 烯醇酶（EC 4. 2. 1. 11)，NP342405. 1 ;得自硫磺礦硫化葉菌的丙酮酸激酶（EC 2. 7. 1. 40)， NP342465. 1 ;得自干熱嗜苦菌（Picrophilus torridus)的甘油酸脫氫酶/羥基丙酮酸還原 酶（EC I. I. I. 29/1. I. 1. 81)，YP_023894. 1 ;得自硫磺礦硫化葉菌的絲氨酸-丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶 (EC 2.6. 1.51)，NCBI Gen ID:NP_343929. 1 ;得自嗜熱棲熱菌（Thermus thermophilus)的 L-絲氨酸解氨酶（EC 4. 3. 1. 17)，YP_144295. 1和YP_144005. 1 ;和得自嗜熱棲熱菌的丙氨 酸脫氫酶（EC 1. 4. I. I)，NCBI-Gen ID:YP_005739. 1〇
[0065] 本發(fā)明的方法，其中葡萄糖向丙酮酸的轉(zhuǎn)化由一摩爾葡萄糖轉(zhuǎn)化為兩摩爾丙酮酸 構(gòu)成。
[0066] 本發(fā)明的方法，其中丙酮酸進一步轉(zhuǎn)化為目標化學(xué)品，且其中在該轉(zhuǎn)化過程中，相 對于每分子的丙酮酸，1 ( 一）摩爾NADH轉(zhuǎn)化為1 ( 一）分子NAD，并且其中該目標化學(xué)品優(yōu) 選地選自乙醇、異丁醇、正丁醇和2-丁醇。
[0067] 本發(fā)明的方法，其中包括在任一表格E-1、1-1、N-l、T-1、T-2和T_2a中的酶組合 中的一種被采用用于丙酮酸向各個目標化學(xué)品的轉(zhuǎn)化。
[0068] 本發(fā)明的方法，其中目標化學(xué)品為乙醇，用于丙酮酸向乙醇轉(zhuǎn)化的酶選自：得自 運動發(fā)酵單孢菌（Zymomonas mobilis)的丙酮酸脫羧酶4.1.1.1)，Seq ID 20; 和得自嗜熱脂肪地芽孢桿菌（Geobacillus stearothermophilus)的醇脫氫酶ADH(EC I. I. I. I), Seq ID 18〇
[0069] 本發(fā)明的方法，其中目標化學(xué)品為異丁醇，用于丙酮酸向異丁醇的轉(zhuǎn)化的酶選 自：枯草芽抱桿菌（Bacillus subtilis)的乙醜乳酸合酶ALS(EC 2.2.1.6)，Seq ID 12; 得自硫磺礦硫化葉菌的乙酰乳酸合酶ALS (EC 2. 2. 1. 6)，NCBI-GenID: NP_342102. 1 ; 得自海棲熱袍菌（Thermotoga maritima)的乙酰乳酸合成酶ALS(EC:2. 2. L 6)， NCBI-GeneID: ΝΡ_228358· 1 ;得自紅色亞棲熱菌（Meiothermus ruber)的酮醇酸還原 異構(gòu)酶KARI (EC 1.1.1.86)，Seq ID 14;得自硫磺礦硫化葉菌的酮醇酸還原異構(gòu)酶 KARI(EC I. 1. 1.86)，NCBI-GenID:NP_342100. 1 ;得自海棲熱袍菌的酮醇酸還原異構(gòu)酶 KARI (EC. I. I. 1. 86)，NCBI-GeneID:NP_228360. 1 ;得自乳酸乳球菌（Lactococcus Iactis) 的支鏈-2-含氧酸脫羧酶KDC (EC 4. I. 1. 72)，Seq ID 16 ;得自乳酸乳球菌的α -酮異戊 酸脫羧酶KDC，（EC 4. I. 1.-)，NCBI-GeneID:CAG34226. 1 ;得自硫磺礦硫化葉菌的二羥酸脫 水酶DHAD (EC4. 2. 1.9)，NP 344419. 1，Seq ID 04 ;得自海棲熱袍菌的二羥酸脫水酶DHAD， (EC:4. 2. 1.9)，NCBI-GeneID:NP_228361. 1 ;得自嗜熱脂肪地芽孢桿菌的醇脫氫酶ADH(EC 1.1.1.1)，369 10 18;得自卩1&￥<^3(^61'；[11111；1^'丨8丨(1;[1]^1'丨8的醇脫氫酶六0!1出〇1.1.1.1)， NCBI-GenlD:BAB91411. 1 ;和得自釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)的醇脫氛酶 ADH(EC: I. I. I. I) 〇
[0070] 本發(fā)明的方法，其中，優(yōu)選通過萃取、滲透萃取、蒸餾、吸附、汽提、滲透蒸發(fā)、膜萃 取或反滲透將產(chǎn)物持續(xù)地或以批次模式從反應(yīng)中移出。
[0071] 本發(fā)明的方法，其中所用酶對于各個目標化學(xué)品的溶劑耐受性優(yōu)選好于1% (w/ w)，更優(yōu)選為好于4% (w/w)，再更優(yōu)選為好于6% (w/w)，且最優(yōu)選為好于10% (w/w)。
[0072] 本發(fā)明的方法，其中步驟（1)和/或（3)中涉及的一種酶或幾種酶通過對輔因子 具有更高的比活而使其對該單一輔因子優(yōu)化。
[0073] 本發(fā)明的方法，其中優(yōu)化的酶分別與SEQ ID NO. 8或SEQ ID NO. 2相比具有至少 50 %、優(yōu)選為70 %、更優(yōu)選為80 %、再更優(yōu)選為90 %、再更優(yōu)選為95 %、最優(yōu)選為97 %、最高 度優(yōu)選為99%的序列同一性，并且與SEQ ID NO. 8或SEQ ID NO. 2相比具有改善的對于該 輔因子的比活。
[0074] 本發(fā)明的方法，其中在0. 2ml的總反應(yīng)體積中，作為底物的甘油醛/甘油酸為ImM 且輔因子為2mM時，酶在50°C和pH 7.0對該輔因子具有0.4U/mg或更高的比活。優(yōu)選的實 施方式為，其中比活為〇. 6U/mg或更高，更優(yōu)選為0. 8U/mg或更高，再更優(yōu)選為1.0 U/mg或 更高，最優(yōu)選為I. 2U/mg或更高，且最高度優(yōu)選為I. 5U/mg或更高。
[0075] 本發(fā)明的方法，其中比活在3%異丁醇的存在下測定。
[0076] 本發(fā)明的方法，其中步驟（1)和/或（3)中涉及的酶為醛脫氫酶。
[0077] 本發(fā)明的方法，其中上述醛脫氫酶屬于類別EC I. I. 1. 47。
[0078] 本發(fā)明的方法，其中醛脫氫酶選自SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO 57、SEQ ID NO 59、 SEQ ID NO 6USEQ ID NO 63, SEQ ID NO 65, SEQ ID NO 67, SEQ ID NO 69〇
[0079] 上述實施方式可以結(jié)合以提供本發(fā)明的其他特定實施方式。
[0080] 本發(fā)明涉及由糖源以生物技術(shù)制