一種鎳-纖維蛋白原螯合物及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及檢測領(lǐng)域，更具體地說，設(shè)及一種鑲-纖維蛋白原馨合物及其制備方 法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 纖維蛋白原（fibrinogen,FG)其生理功能主要是作為凝血因子I而直接參與凝 血過程。在凝血共同途徑中，凝血酶先裂解纖維蛋白原兩條Aa鏈氨基端Argl6-Glyl7 釋放出一對纖維蛋白膚A，形成纖維蛋白單體I ;在裂解纖維蛋白原兩條B0鏈氨基端 Argl4-Glyl5釋放出一對纖維蛋白膚B，形成纖維蛋白單體II，暴露纖維蛋白單體的聚合部 位，通過非共價結(jié)合，形成了不穩(wěn)定的可溶性纖維蛋白單體。在活化的凝血因子XIII及Ca" 的作用下，纖維蛋白單體互相交聯(lián)，生成穩(wěn)定的可溶性纖維蛋白，并將血液的有形成分包繞 其中，形成牢固的血栓。
[0003] 除參與凝血外，纖維蛋白原還具有其他多種功能，如與血小板膜糖蛋白II b/ III a 結(jié)合而介導(dǎo)血小板聚集反應(yīng)，參與動脈粥樣硬化及腫瘤血行轉(zhuǎn)移等；纖維蛋白原水平還影 響血液粘度，尤其近年來人們發(fā)現(xiàn)血漿纖維蛋白原水平升高是屯、腦血管、血栓性疾病的重 要危險因素。血漿纖維蛋白原也是急性時相蛋白，在很多應(yīng)激狀況下，如感染、嚴(yán)重外傷等 也可短時間內(nèi)升高。
[0004] 鑲作為一種常見的有毒金屬，廣泛應(yīng)用于生活、生產(chǎn)之中，包括生產(chǎn)硬幣、珠寶、鑲 合金不誘鋼、制造Ni-Cd電池等，與人們的生活息息相關(guān)。隨著科技的進(jìn)步，人們將鑲作為 催化劑用于生產(chǎn)碳納米顆粒的生產(chǎn)之中，又進(jìn)一步加深了鑲對于人類的影響。對于普通人 群，鑲主要是通過食入、飲入、接觸等方式攝入鑲，當(dāng)然吸煙也是一重要途徑。研究發(fā)現(xiàn)，過 量的鑲會導(dǎo)致機(jī)體多處組織及器官損傷，導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生，包括呼吸系統(tǒng)疾?。ǚ窝住?支氣管炎、肺纖維化、哮喘、肺水腫等）、屯、血管疾病、腎臟疾病、皮膚疾病等，甚至還會導(dǎo)致 腫瘤的發(fā)生。
[0005] 流行病學(xué)資料顯示，長期接觸鑲的工人，其患呼吸系統(tǒng)腫瘤的幾率大大增加，并且 其因呼吸系統(tǒng)腫瘤致死的幾率也大大增加。動物模型、體外模型試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，鑲可W誘導(dǎo)腫 瘤的發(fā)生。1990年，國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（InternationalAgencyforResearchonCancer, lARC)已將鑲化合物作為第一類致癌物質(zhì)佑roup1)，將金屬鑲作為2B類致癌物質(zhì)佑roup 2B)?？梢?，鑲嚴(yán)重威脅人體的健康。
[000引鑲與多種蛋白質(zhì)之間關(guān)系密化可W與多種蛋白質(zhì)結(jié)合，抑制多種蛋白酶的活性。 隨著對鑲毒性研究的深入，人們逐漸認(rèn)識到鑲與蛋白的相互作用在其致毒過程中扮演著重 要的角色，被認(rèn)為是了解鑲的毒性機(jī)理的關(guān)鍵所在，因此，對鑲和蛋白質(zhì)相互作用的研究就 顯得愈發(fā)重要。而現(xiàn)在關(guān)于鑲與蛋白質(zhì)作用的機(jī)理僅是冰山一角，還有很多蛋白質(zhì)與鑲之 間的關(guān)系還不清楚，因而加強(qiáng)對于鑲與蛋白質(zhì)之間的關(guān)系至關(guān)重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 針對鑲污染嚴(yán)重的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種鑲-纖維蛋白原馨合物及其 制備方法，并建立鑲-纖維蛋白原馨合物的定性、定量檢測方法，W便定量檢測鑲-纖維蛋 白原馨合物在評價一個地區(qū)鑲污染程度的應(yīng)用。通過定量檢測一個地區(qū)人群血清中鑲-纖 維蛋白原馨合物可W間接反映該個地區(qū)人群受鑲污染的情況，從而間接反映該個地區(qū)鑲污 染程度。
[0008] 本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是；提供一種鑲-纖維蛋白原馨合物， 鑲離子與纖維蛋白原通過琉基或/和半脫氨酸殘基馨合而成。
[0009] 本發(fā)明還提供一種上述的鑲-纖維蛋白原馨合物的制備方法，包括W下步驟：
[0010] A)鑲與纖維蛋白原的馨合反應(yīng)：在提純源于人體的纖維蛋白原或按照生物學(xué)方 法重組的纖維蛋白原中加入鑲離子進(jìn)行馨合反應(yīng)，得到反應(yīng)溶液；
[0011] B)純化鑲-纖維蛋白原馨合物的提取；采用免疫親和層析法，去除反應(yīng)溶液中未 反應(yīng)的纖維蛋白原W及多余的鑲離子，即得鑲-纖維蛋白原馨合物。
[0012] 其中，體外合成法中所述步驟B)具體如下：
[001引 （1)溶解樣品；向經(jīng)過步驟A)得到的反應(yīng)溶液中加入生理鹽水使鑲-纖維蛋白原 馨合物復(fù)溶；
[0014] 似平衡層析柱；使用稀釋緩沖液沖洗層析柱的管路，在層析柱中裝入能與纖維 蛋白原特異性結(jié)合的填料，裝柱后，繼續(xù)使用稀釋緩沖液平衡層析柱；
[0015] (3)上樣；待層析柱平衡后，用稀釋緩沖液稀釋步驟（1)中樣品，然后上柱，纖維蛋 白原與填料特異性結(jié)合；
[0016] (4)洗脫；使用稀釋緩沖液沖洗層析柱至基線平衡，然后使用0. 05-0.Imol/L的磯 酸鹽溶液進(jìn)行洗脫，得到洗脫液I;
[0017] 妨收集：收集洗脫液I;
[0018] (6)透析；將步驟巧）中的收集的洗脫液，裝透析袋，用d地2〇透析除鹽，換水S次 后，4°C透析過夜，收集樣本；
[0019] (7)平衡層析柱；采用新的層析柱，用稀釋緩沖液沖洗管路，在該層析柱中裝入能 與鑲特異性結(jié)合的填料，裝柱后再用稀釋緩沖液平衡層析柱；
[0020] (8)上樣；待層析柱平衡后，用稀釋緩沖液稀釋步驟化）中樣本，然后上柱；
[0021] (9)洗脫；使用稀釋緩沖液沖洗層析柱至基線平衡，然后使用0. 5-1.Omol/L的磯 酸鹽溶液進(jìn)行洗脫，得到洗脫液II;
[00過 （10)收集；收集洗脫液II;
[002引 （11)透析；將步驟（10)中的收集的洗脫液，裝透析袋，用(1化0透析除鹽，換水立 次后，4°C透析過夜，收集樣本，即得鑲-纖維蛋白原馨合物。
[0024] 其中，上述鑲-纖維蛋白原馨合物的制備方法，還包括步驟C);對鑲-纖維蛋白原 馨合物的鑒定；
[0025] 其中，步驟C)中具體如下；
[0026] (1)制備膠床；W瓊脂糖凝膠、聚丙締酷胺凝膠中的一種作為介質(zhì)制備膠床；
[0027] 似加樣；取步驟B)中提取純化得到的鑲-纖維蛋白原馨合物，加入稀釋緩沖液， 并混勻，然后加樣于樣品槽中；
[002引做電泳：連接電泳板，進(jìn)行電泳；
[0029] (4)檢測；在膠床上找出含鑲的蛋白條帶，將該蛋白條帶取出并溶解，然后再采用 ELISA法或ICP-MS法或AAS法檢測是否含有鑲W及檢測鑲的含量。
[0030] 本發(fā)明還提供一種如上述的鑲-纖維蛋白原馨合物在制備檢測人體內(nèi)鑲-纖維蛋 白原馨合物的試劑或試劑盒中的應(yīng)用。
[0031] 本發(fā)明還提供一種至少包括如上述的鑲-纖維蛋白原馨合物作為標(biāo)準(zhǔn)品的試劑 盒。
[0032] 優(yōu)選地，該試劑盒中還包括包被液，該包被液含有捕獲纖維蛋白原的物質(zhì)或捕獲 鑲的物質(zhì)。
[0033] 本發(fā)明還提供一種定量檢測鑲-纖維蛋白原馨合物的方法，W已知含量的上述的 鑲-纖維蛋白原馨合物作為標(biāo)準(zhǔn)品，采用W下方法之一對樣品進(jìn)行檢測：酶聯(lián)免疫法、酶聯(lián) 免疫與原子吸收光譜結(jié)合法、酶聯(lián)免疫與電感禪合等離子體質(zhì)譜結(jié)合法、提純鑲-纖維蛋 白原馨合物與酶聯(lián)免疫結(jié)合法、提純鑲-纖維蛋白原馨合物與原子吸收光譜結(jié)合法、提純 鑲-纖維蛋白原馨合物與電感禪合等離子體質(zhì)譜結(jié)合法、電泳與酶聯(lián)免疫或原子吸收光譜 或電感禪合等離子體質(zhì)譜結(jié)合法。
[0034] 實(shí)施本發(fā)明的鑲-纖維蛋白原馨合物及其制備方法和應(yīng)用，具有W下有益效果：
[0035] 1.本發(fā)明首次體外合成鑲-纖維蛋白原馨合物；
[0036] 2.本發(fā)明首次提出鑲-纖維蛋白原馨合物可用于制備檢測血樣中鑲-纖維蛋白原 馨合物的試劑或試劑盒中的應(yīng)用。
[0037] 3.本發(fā)明建立了鑲-纖維蛋白原馨合物的定性定量檢測方法，W便定量檢測 鑲-纖維蛋白原馨合物在評價一個地區(qū)鑲污染程度的應(yīng)用。通過定量檢測一個地區(qū)人群血 清中鑲-纖維蛋白原馨合物可W間接反映該個地區(qū)人群受鑲污染的情況，從而間接反映該 個地區(qū)鑲污染程度。本發(fā)明建立的鑲-纖維蛋白原馨合物定量檢測方法其準(zhǔn)確度大大提 高，并且使檢測的重復(fù)性得到大大提高。
【附圖說明】
[003引圖1為本發(fā)明所述的鑲-纖維蛋白原馨合物的非變性電泳條帶圖；
[0039] 圖2為本發(fā)明所述的鑲-纖維蛋白原馨合物的電泳條帶的同步福射X線巧光分析 圖。
【具體實(shí)施方式】
[0040] 下面，結(jié)合【具體實(shí)施方式】，對本發(fā)明做進(jìn)一步描述：
[0041] 本發(fā)明除特別說明外，設(shè)及的實(shí)驗(yàn)操作步驟均為本領(lǐng)域常規(guī)的步驟，所用試劑、材 料如下述所列舉，在本發(fā)明中沒有列舉出來的均為本領(lǐng)域常用的試劑或可W通過市購方式 獲得：
[0042] 磯酸鹽溶液為0. 05-0.Imol/L化2冊〇4溶液或0. 5-lmol/L化2冊〇4溶液；
[0043] 提取試劑為PEG溶液、棚酸鹽緩沖液等（采用PEG法）；
[0044] 膠床介質(zhì)為瓊脂糖凝膠、聚丙締酷胺凝膠中的一種；
[0045] 捕獲纖維蛋白原的物質(zhì)購買自Novus公司型號為A-0577的人纖維蛋白原抗體；其 中，本發(fā)明所述與纖維蛋白原特異性結(jié)合的物質(zhì)、抗FG抗體、抗纖維蛋白原抗體均為捕獲 纖維蛋白原的物質(zhì)；
[0046] 捕獲鑲的物質(zhì)為廣州然科生物科技有限公司生產(chǎn)的型號為服14419的鼠抗Ni mAb;其中，本發(fā)明所述與鑲特異性結(jié)合的物質(zhì)、抗Ni抗體、抗鑲抗體、鑲抗均為捕獲鑲的物 質(zhì)；
[0047] 酶標(biāo)抗體為含有辣根過氧化物酶、堿性磯酸酶等酶標(biāo)記的抗體中的一種；
[0048] 底物為甲基聯(lián)苯胺（TMB)溶液；
[0049] 洗漆液為含有KH2PO40. 2mg/ml、化2冊〇4? 12&0 2. 90mg/ml、化C18.Omg/ml、KC1 0. 2mg/ml、0. 5%Tween-20 的抑為 7. 4 的 0. 15MPBS溶液；
[0050] 封閉液為1% -5 %牛血清白蛋白或脫脂奶粉；
[0051] 稀釋緩沖液為含 1. 5mg/mL化2〇)3、2. 93mg/mlNaHC〇3的PH為 9.6的 0. 05M碳酸 鹽緩沖液；
[0052] 終止液為：將21. 7ml的2M&8〇4定容至200ml的d地2〇中；
[0053] 洗脫液為含木瓜蛋白酶的PH為8. 0的0.Imol