組，說明該濃度洗脫液洗脫效果最優(yōu)（即將化ISA孔 壁上結(jié)合的抗NiAb-酶標(biāo)復(fù)合物洗脫程度達(dá)到最大，因而0D值最低）；而洗脫時(shí)間不管是 比、化、3h，各組0D值變化均不大，可見隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，酶活力逐漸減弱，在酶濃度不變的 情況下，延長(zhǎng)消化時(shí)間并不能提高消化率，所W本試驗(yàn)中洗脫液的洗脫時(shí)間為1-化皆可。 陽21引麻用連施巧I 1
[0220] 取采用ELISA法檢測(cè)100份標(biāo)本血漿中的鑲-纖維蛋白原馨合物，按照W下步驟 進(jìn)行檢測(cè)；酶聯(lián)免疫法巧LISA法）檢測(cè)鑲-纖維蛋白原馨合物，按照如下步驟檢測(cè)：
[0221] 1)將抗FGAb包被于固相載體上；用稀釋緩沖液將抗FGAb稀釋至1000倍，加入 ELISA板微孔中，37°C水浴1小時(shí)，儲(chǔ)存冰箱；
[0222] 2)從循環(huán)系統(tǒng)取全血，作待檢樣品，lOOOrmp離屯、5-8分鐘，離屯、棄去沉淀；
[0223] 3)封閉；移去稀釋緩沖液，并用洗漆液進(jìn)行洗漆，待洗漆完成后，加2%牛血清白 蛋白作為封閉液，37°C放置1小時(shí)，移去封閉液，并用洗漆液進(jìn)行洗漆，洗漆完成后，ELISA 板于37°C放置1小時(shí)；
[0224] 4)加待檢樣品，并且溫育；加入步驟2)中的待檢樣品、W已知含量的鑲-纖維蛋 白原馨合物作標(biāo)準(zhǔn)品；用稀釋緩沖液將待檢樣品稀釋至40倍，加入微孔中，37°C作用1小 時(shí)；
[0225] 5)加入可W捕獲鑲的物質(zhì)，并且溫育；移去待檢樣品，并用洗漆液進(jìn)行洗漆，待洗 漆完成后，加入用稀釋緩沖液稀釋50000倍，37°C作用1小時(shí)，使抗NiAb與纖維蛋白原上 的金屬鑲反應(yīng)；
[0226] 6)酶結(jié)合物溫育；移去抗鑲抗體，并用洗漆液進(jìn)行洗漆，待洗漆完成后，加入用稀 釋緩沖液稀釋的HRP酶標(biāo)抗體，37°C作用1小時(shí)，使其與酶標(biāo)抗體反應(yīng)；
[0227] 7)底物溫育；移去酶標(biāo)抗體，并用洗漆液進(jìn)行洗漆，待洗漆完成后，加入底物， 37°C避光作用30分鐘；
[022引8)終止反應(yīng)；將終止液滴加至每一微孔；
[0229] 9)取波長(zhǎng)為405nm，加完終止液后，將化ISA板置于酶標(biāo)儀上檢測(cè)，分別讀取待檢 樣品0D值（也可不使用酶標(biāo)儀，直接通過顯色情況進(jìn)行定性檢測(cè)），具體檢測(cè)值如表5所 /J、-〇
[0230] 表5 ;100份血樣標(biāo)本中鑲-纖維蛋白原聲合物的化ISA檢測(cè)結(jié)果
[0231]
陽23引麻用連施巧I2
[0233] 采用酶聯(lián)免疫與原子吸收光譜結(jié)合法巧LISA法+AAS法）檢測(cè)100分標(biāo)本血樣中 的鑲-纖維蛋白原馨合物，按照如下步驟檢測(cè)：
[0234] 1)將能夠捕獲纖維蛋白原的物質(zhì)，如抗纖維蛋白原抗體（抗FGAb)包被于固相載 體上；用稀釋緩沖液將抗FGAb稀釋至1000倍，加入化ISA板微孔中，4°C過夜18小時(shí)；
[0235] 2)從循環(huán)系統(tǒng)取全血，作待檢樣品，lOOOrmp離屯、5-8分鐘，離屯、棄去沉淀；
[0236] 3)封閉；移去稀釋緩沖液，并用洗漆液進(jìn)行洗漆，待洗漆完成后，加入2%牛血清 白蛋白或脫脂奶粉作為封閉液，37°C放置1小時(shí)，移去封閉液，并用洗漆液進(jìn)行洗漆，洗漆 完成后，ELISA板于37°C放置1小時(shí)；
[0237] 4)加待檢樣品，并且溫育；加入步驟。中的待檢樣品、W已知含量的鑲-纖維蛋 白原馨合物作標(biāo)準(zhǔn)品；用稀釋緩沖液將待檢樣品稀釋至40倍，加入微孔中，37°C作用1小 時(shí)；
[023引 5)洗脫；移去待檢樣品，并用洗漆液進(jìn)行洗漆，待洗漆完成后，加入木瓜蛋白酶濃 度為10化g/ml的洗脫液，洗脫1-3小時(shí)；
[0239] 6)檢測(cè)；從化ISA板的微孔中取樣，于原子吸收光譜儀檢測(cè)馨合于纖維蛋白原上 的鑲，檢測(cè)值如表6所示。
[0240] 表6 ;100份血樣標(biāo)本中鑲-纖維蛋白原聲合物的AAS檢測(cè)結(jié)果
[0241]
[0242]
陽24引 麻用連施巧I3
[0244] 采用酶聯(lián)免疫與電感禪合等離子體質(zhì)譜結(jié)合法巧LISA法+ICP-MS法）檢測(cè)100 分標(biāo)本血樣中的鑲-纖維蛋白原馨合物含量，按照如下步驟檢測(cè)：
[024引1)將能夠捕獲纖維蛋白原的物質(zhì)，如抗纖維蛋白原抗體（抗FGAb)包被于固相載 體上；用稀釋緩沖液將抗FGAb稀釋至1000倍，加入化ISA板微孔中，4°C過夜18小時(shí)； [024引。取100份標(biāo)準(zhǔn)血樣作為待檢樣品，lOOOrmp離屯、5-8分鐘，離屯、棄去沉淀； [0247] 3)封閉；移去稀釋緩沖液，并用洗漆液進(jìn)行洗漆，待洗漆完成后，加入2%牛血 清白蛋白作為封閉液，37°C放置1小時(shí)，移去封閉液，并用洗漆液進(jìn)行洗漆，洗漆完成后，ELISA板于37°C放置1小時(shí)；
[024引 4)加待檢樣品，并且溫育；加入步驟2)中的待檢樣品、W已知含量的鑲-纖維蛋 白原馨合物作標(biāo)準(zhǔn)品；用稀釋緩沖液將待檢樣品稀釋至40倍，加入微孔中，37°C作用1小 時(shí)；
[0249] 5)洗脫；移去待檢樣品，并用洗漆液進(jìn)行洗漆，待洗漆完成后，加入木瓜蛋白酶濃 度為10化g/ml的洗脫液，洗脫1-3小時(shí)；
[0250] 6)酸化；在步驟W中的溶液中加入硝酸對(duì)溶液進(jìn)行酸化，封日過夜，徹底酸化，加 入過氧化氨，并且加熱趕酸；
[0巧1] 7)檢測(cè)；從步驟6)得到的溶液中取樣，于電感禪合等離子體質(zhì)譜儀下檢測(cè)馨合于 纖維蛋白原的鑲，檢測(cè)值如表7所示。
[0巧2] 表7 ;100份血樣標(biāo)本中鑲-纖維蛋白原馨合物的ICP-MS檢測(cè)結(jié)果
[0 巧 3]
[0255] 對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，可根據(jù)W上描述的技術(shù)方案W及構(gòu)思，做出其它各種 相應(yīng)的改變W及形變，而所有的該些改變W及形變都應(yīng)該屬于本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍 之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種鎳-纖維蛋白原螯合物，其特征在于，鎳離子與纖維蛋白原通過巰基或/和半胱 氨酸殘基螯合而成。2. -種如權(quán)利要求1所述的鎳-纖維蛋白原螯合物的制備方法，其特征在于，包括以下 步驟： A) 鎳與纖維蛋白原的螯合反應(yīng)：在提純?cè)从谌梭w的纖維蛋白原或按照生物學(xué)方法重 組的纖維蛋白原中加入鎳離子進(jìn)行螯合反應(yīng)，得到反應(yīng)溶液； B) 純化鎳-纖維蛋白原螯合物的提?。翰捎妹庖哂H和層析法，去除反應(yīng)溶液中未反應(yīng) 的纖維蛋白原以及多余的鎳離子，即得鎳-纖維蛋白原螯合物。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于， 所述步驟B)具體如下： (1) 溶解樣品：向經(jīng)過步驟A)得到的反應(yīng)溶液中加入生理鹽水使鎳-纖維蛋白原螯合 物復(fù)溶； (2) 平衡層析柱：使用稀釋緩沖液沖洗層析柱的管路，在層析柱中裝入能與纖維蛋白 原特異性結(jié)合的填料，裝柱后，繼續(xù)使用稀釋緩沖液平衡層析柱； ⑶上樣：待層析柱平衡后，用稀釋緩沖液稀釋步驟⑴中樣品，然后上柱，纖維蛋白原 與填料特異性結(jié)合； (4) 洗脫：使用稀釋緩沖液沖洗層析柱至基線平衡，然后使用0. 05-0. lmol/L的磷酸鹽 溶液進(jìn)行洗脫，得到洗脫液I ; (5) 收集：收集洗脫液I ; (6) 透析：將步驟（5)中的收集的洗脫液，裝透析袋，用ddH20透析除鹽，換水三次后， 4 °C透析過夜，收集樣本； (7) 平衡層析柱：采用新的層析柱，用稀釋緩沖液沖洗管路，在該層析柱中裝入能與鎳 特異性結(jié)合的填料，裝柱后再用稀釋緩沖液平衡層析柱； (8) 上樣：待層析柱平衡后，用稀釋緩沖液稀釋步驟（6)中樣本，然后上柱； (9) 洗脫：使用稀釋緩沖液沖洗層析柱至基線平衡，然后使用0. 5-1. Omol/L的磷酸鹽 溶液進(jìn)行洗脫，得到洗脫液II ; (10) 收集：收集洗脫液II ; (11) 透析：將步驟（10)中的收集的洗脫液，裝透析袋，用ddH20透析除鹽，換水三次 后，4°C透析過夜，收集樣本，即得鎳-纖維蛋白原螯合物。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的鎳-纖維蛋白原螯合物的制備方法，其特征在于，還包括步驟 C):對(duì)鎳-纖維蛋白原螯合物的鑒定； 其中，步驟C)中具體如下： (1) 制備膠床：以瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠中的一種作為介質(zhì)制備膠床； (2) 加樣：取步驟B)中提取純化得到的鎳-纖維蛋白原螯合物，加入稀釋緩沖液，并混 勻，然后加樣于樣品槽中； (3) 電泳：連接電泳板，進(jìn)行電泳； (4) 檢測(cè)：在膠床上找出含鎳的蛋白條帶，將該蛋白條帶取出并溶解，然后再采用 ELISA法或ICP-MS法或AAS法檢測(cè)是否含有鎳以及檢測(cè)鎳的含量。5. -種如權(quán)利要求1所述的鎳-纖維蛋白原螯合物在制備檢測(cè)血樣中鎳-纖維蛋白原 螯合物的試劑或試劑盒中的應(yīng)用。6. -種至少包括如權(quán)利要求1所述的鎳-纖維蛋白原螯合物作為標(biāo)準(zhǔn)品的試劑盒。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于，還包括包被液，該包被液含有捕獲纖維 蛋白原的物質(zhì)或捕獲鎳的物質(zhì)。8. -種定量檢測(cè)鎳-纖維蛋白原螯合物的方法，其特征在于，以已知含量的權(quán)利要求 1所述的鎳-纖維蛋白原螯合物作為標(biāo)準(zhǔn)品，采用以下方法之一對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)：酶聯(lián)免 疫法、酶聯(lián)免疫與原子吸收光譜結(jié)合法、酶聯(lián)免疫與電感耦合等離子體質(zhì)譜結(jié)合法、提純 鎳-纖維蛋白原螯合物與酶聯(lián)免疫結(jié)合法、提純鎳-纖維蛋白原螯合物與原子吸收光譜結(jié) 合法、提純鎳-纖維蛋白原螯合物與電感耦合等離子體質(zhì)譜結(jié)合法、電泳與酶聯(lián)免疫或原 子吸收光譜或電感耦合等離子體質(zhì)譜結(jié)合法。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種鎳-纖維蛋白原螯合物及其制備方法和應(yīng)用，該鎳-纖維蛋白原螯合物是鎳離子與纖維蛋白原通過巰基或/和半胱氨酸殘基螯合而成。本發(fā)明建立了鎳-纖維蛋白原螯合物的定性定量檢測(cè)方法，以便定量檢測(cè)鎳-纖維蛋白原螯合物在評(píng)價(jià)一個(gè)地區(qū)鎳污染程度的應(yīng)用。通過定量檢測(cè)一個(gè)地區(qū)人群血清中鎳-纖維蛋白原螯合物可以間接反映這個(gè)地區(qū)人群受鎳污染的情況，從而間接反映這個(gè)地區(qū)鎳污染程度。本發(fā)明建立的鎳-纖維蛋白原螯合物定量檢測(cè)方法其準(zhǔn)確度大大提高，并且使檢測(cè)的重復(fù)性得到大大提高。
【IPC分類】C07K1/22, G01N33/96, C07K14/75, G01N33/86
【公開號(hào)】CN104987384
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510411286
【發(fā)明人】張積仁, 陽帆, 董欣敏, 吳婧, 蔡睿, 孫遙, 趙乙木
【申請(qǐng)人】上海拜豪生物科技有限公司
【公開日】2015年10月21日
【申請(qǐng)日】2015年7月14日