. 0,然后緩慢逐漸滴加80y1 的Immol/L鑲離子溶液，邊滴加邊振蕩，W免鑲離子使蛋白變性沉淀；
[0159] 6)將步驟5)所得的溶液置于溫度為25。轉(zhuǎn)速為l(K)r/min的搖床中反應(yīng)2h，用 透析袋進(jìn)行透析2化；
[0160] 7)將步驟6)透析后的液體于-20°C分裝保存，得到反應(yīng)溶液。
[0161]B)純化鑲-纖維蛋白原馨合物的提取；采用免疫親和層析法，去除反應(yīng)溶液（即 步驟7)得到反應(yīng)溶液）中未反應(yīng)的纖維蛋白原W及多余的鑲離子，即得鑲-纖維蛋白原馨 合物，具體步驟如下：
[0162] (1)溶解樣品；向經(jīng)過步驟7)得到的反應(yīng)溶液中加入生理鹽水使鑲-纖維蛋白原 馨合物復(fù)溶；
[0163] (2)平衡層析柱；使用稀釋緩沖液沖洗層析柱的管路，在層析柱中裝入能與纖維 蛋白原特異性結(jié)合的填料，裝柱后，繼續(xù)使用稀釋緩沖液平衡層析柱；
[0164] 做上樣：待層析柱平衡后，用稀釋緩沖液稀釋步驟（1)中樣品，然后上柱，纖維蛋 白原與填料特異性結(jié)合；
[0165] (4)洗脫；使用稀釋緩沖液沖洗層析柱至基線平衡，然后使用0. 05-0.Imol/L的磯 酸鹽溶液進(jìn)行洗脫，得到洗脫液I;
[016引 妨收集：收集洗脫液I;
[0167] (6)透析；將步驟巧）中的收集的洗脫液，裝透析袋，用d地2〇透析除鹽，換水S次 后，4°C透析過夜，收集樣本；
[0168] (7)平衡層析柱；采用新的層析柱，用稀釋緩沖液沖洗管路，在該層析柱中裝入能 與鑲特異性結(jié)合的填料，裝柱后再用稀釋緩沖液平衡層析柱；
[0169] (8)上樣；待層析柱平衡后，用稀釋緩沖液稀釋步驟化）中樣本，然后上柱；
[0170] (9)洗脫；使用稀釋緩沖液沖洗層析柱至基線平衡，然后使用0. 5-1.Omol/L的磯 酸鹽溶液進(jìn)行洗脫，得到洗脫液II;
[0171] (10)收集；收集洗脫液II;
[017引（11)透析；將步驟（10)中的收集的洗脫液，裝透析袋，用2升(1化0透析除鹽，換 水=次后，4°C透析過夜，收集樣本，即得鑲-纖維蛋白原馨合物；
[0173] C)對鑲-纖維蛋白原馨合物的鑒定，具體步驟如下：
[0174] (1)制備膠床；W瓊脂糖凝膠作為介質(zhì)制備膠床；
[017引 似加樣；取步驟B)中8化提取純化得到的鑲-纖維蛋白原馨合物，加入2化上 樣緩沖液，并混勻，然后加樣于樣品槽中；
[0176] (3)電泳；連接電泳板，加入電泳緩沖液進(jìn)行電泳；電泳過程中，電流為22mA恒流， 環(huán)境溫度為4°C;電泳至漠酪藍(lán)移至膠底部時(shí)停止電泳；
[0177] (4)檢測；在膠床上找出含鑲的蛋白條帶，將該蛋白條帶取出并溶解，然后再采用 ELISA法或ICP-MS法或AAS法檢測是否含有鑲W及檢測鑲的含量。
[017引 D)檢測結(jié)果
[0179] (1)石墨爐原子吸收光譜法（AA巧初步測定FG中重金屬含量：結(jié)果見表1
[0180] 表1為纖維蛋白原中重金屬含量（yg/L)
[0181]
[0182]
[0183] (2)電泳結(jié)果；
[0184] 其中，圖1為本發(fā)明所述的鑲-纖維蛋白原馨合物的非變性電泳條帶圖。
[0185] 非變性聚丙締酷胺凝膠電泳（化tive-PAG巧或稱為活性電泳是在不加入SDS和疏 基己醇等變性劑的條件下，對保持活性的蛋白質(zhì)進(jìn)行聚丙締酷胺凝膠電泳，常用于酶的鑒 定、同工酶分析和提純。未加SDS的天然聚丙締酷胺凝膠電泳可W使生物大分子在電泳過 程中保持其天然的形狀和電荷，它們的分離是依據(jù)其電泳遷移率的不同和凝膠的分子篩作 用，因而可W得到較高的分辨率，尤其是在電泳分離后仍能保持蛋白質(zhì)和酶等生物大分子 的生物活性，因此左邊泳道M為變性Marker,只用于檢測，沒有標(biāo)記作用，泳道1、3、5為纖維 蛋白原的條帶。
[0186] (3)同步福射X巧光分析；
[0187] 蛋白條帶內(nèi)微量元素含量的SRXRF分析在北京正負(fù)電子對撞機(jī)任EPC)的4W1" 同步福射束線上完成。儲(chǔ)存環(huán)中電子束流能量為2. 2GeV，束流強(qiáng)度100mA。樣品移動(dòng)臺(tái) (TSA200型，北京卓立漢光公司）可在計(jì)算機(jī)控制的步進(jìn)馬達(dá)驅(qū)動(dòng)下沿X、Y二維方向上移 動(dòng)W改變?nèi)肷涔獍呶恢?，移?dòng)步長為0. 0025mm。從樣品發(fā)射出的X射線由Si(Li)探測器 (PGTInc.LS30143-D巧探測，探頭與入射SR線共平面且相互垂直，距樣品照射點(diǎn)20mm，信 號(hào)用PGT多道分析儀（MCA4000)獲取輸出。用11.化eV的單色同步福射光激發(fā)樣品，調(diào)節(jié) 入射光斑（lmmx3mm)位置使之處于條帶一端，在300s的測定時(shí)間內(nèi)，光斑一直沿條帶均勻 緩慢移動(dòng)，計(jì)數(shù)結(jié)束時(shí)光斑移到該條帶另一端。沿電泳方向每1mm取一個(gè)譜。采用AXIL軟件處理數(shù)據(jù)，并用來源于空氣且含量恒定的Ar信號(hào)峰對其它元素峰進(jìn)行歸一處理，W抵 消束流強(qiáng)度變化對信號(hào)強(qiáng)弱產(chǎn)生的影響。在相同的條件下W同樣的方式測量定量標(biāo)準(zhǔn)干膠 膜的巧光譜。
[018引圖2為本發(fā)明所述的鑲-纖維蛋白原馨合物的電泳條帶的同步福射X線巧光分析 圖，圖中橫坐標(biāo)為蛋白條帶位置，縱坐標(biāo)為該條帶各金屬能量（含量）值。 陽18引 本發(fā)巧一種定量檢測衡-纖維帝白原臀合物的方法的檢測條件的確定:
[0190] 1.抗纖維蛋白原抗體、抗鑲抗體最佳工作濃度W及血漿的最佳稀釋倍數(shù)的確定
[0191] 步驟如下：
[019引 （1)將抗FGAb用稀釋緩沖液按照抗FGAb與稀釋緩沖液的質(zhì)量體積比為1:1000、 1:2000、1:4000、1:8000進(jìn)行稀釋，加入化ISA板微孔中，將抗FGAb包被于固相載體上，每 個(gè)濃度包被=排，4°C過夜18小時(shí)；
[0193] (2)移去稀釋緩沖液，并用洗漆液進(jìn)行洗漆，待洗漆完成后，用2%牛血清白蛋白 作為封閉液，37°C放置1小時(shí)，移去封閉液，并用洗漆液進(jìn)行洗漆；
[0194] (3)待檢樣品按待檢樣品與稀釋緩沖液的質(zhì)量體積比為1:20、1:40、1:80進(jìn)行稀 釋，加入微孔中，按照上述包被的抗FGAb濃度，同一個(gè)濃度的抗FGAb的分別加入不同稀 釋度血漿，37°C作用1小時(shí)；
[0195] (4)移去待檢樣品，并用洗漆液進(jìn)行洗漆，待洗漆完成后，加入抗NiAb，抗NiAb 按抗NiAb與稀釋緩沖液的質(zhì)量體積比為1:50000、1:100000、1:200000、1:400000進(jìn)行稀 釋，按照每一個(gè)相同抗FGAb、全血稀釋濃度，不同濃度抗NiAb各加2孔，37°C作用1小時(shí)， 使抗NiAb與FG上的金屬鑲反應(yīng)；
[0196] (5)酶標(biāo)抗體選擇最適工作濃度，即2yg/mU移去抗Ni抗體，并用洗漆液進(jìn)行洗 漆，待洗漆完成后，加入用稀釋緩沖液稀釋HRP酶標(biāo)抗體，37°C作用1小時(shí)，使HRP酶標(biāo)抗體 與鑲-纖維蛋白原馨合物反應(yīng)；
[0197] (6)移去酶標(biāo)抗體，并用洗漆液進(jìn)行洗漆，待洗漆完成后，加入底物，37°C避光作用 30分鐘；
[0198] (7)將終止液滴加至每一微孔；
[0199] (8)取波長405nm，加完終止液后，將化ISA板置于酶標(biāo)儀上檢測，分別讀取各孔0D 值。根據(jù)各孔0D值數(shù)值，選擇抗FGAb、抗NiAb的最佳工作濃度W及血漿的最佳稀釋倍 數(shù)。
[0200] 試驗(yàn)中同時(shí)W所制標(biāo)準(zhǔn)品作為陽性對照，選擇抗FGAb+封閉+抗NiAb+酶標(biāo)+ 底物（即不加待檢樣品）作為陰性對照1 ;抗FGAb+封閉+血漿+酶標(biāo)+底物（即不加抗 NiAb)作為陰性對照2 ;抗FGAb+封閉+酶標(biāo)+底物（即不加待檢樣品和抗NiAb)作為 陰性對照3 ;抗FGAb+封閉+血漿+抗NiAb+底物（即不加酶標(biāo)）作為陰性對照4 ;封閉 +血漿+抗NiAb+酶標(biāo)+底物（即不加抗FGAb捕獲FG)作為空白對照1 ;只加底物作為 空白對照2及PBS作為空白對照3。檢測結(jié)果見表2-3。
[020。 表2 ;棋盤滴定法確定抗FGAb、抗NiAb的最佳工作濃度W及血漿的最佳稀釋倍 數(shù)的數(shù)據(jù)（每個(gè)數(shù)據(jù)皆為平均值）
[0202]
[020引 由表2-3數(shù)據(jù)顯示，我們可W看出當(dāng)抗FGAb的稀釋度為1:1000、全血稀釋度為 1:40、Ni抗稀釋度為1:50000時(shí)，0D值最大，所W選此值所對應(yīng)的濃度作為最佳工作濃度。
[0206] 2.定量檢測鑲-纖維蛋白原馨合物的方法中方法二、S中洗脫液最佳工作濃度及 洗脫時(shí)間的確定
[0207] 步驟如下；（1)包被；將抗Ni抗體用稀釋緩沖液稀釋至50000倍（質(zhì)量體積比）， 加入化ISA板微孔中，37°C水浴3小時(shí)，儲(chǔ)存冰箱；
[020引 （2)封閉；移去稀釋緩沖液，并用洗漆液進(jìn)行洗漆，待洗漆完成后，用2%牛血清白 蛋白作為封閉液，37°C放置1小時(shí)，移去封閉液，并用洗漆液進(jìn)行洗漆；
[0209] (3)移去封閉液，并用洗漆液進(jìn)行洗漆，待洗漆完成后，加入用稀釋緩沖液稀釋的 酶標(biāo)抗體，酶標(biāo)抗體稀釋至濃度為2yg/mL，37°C作用2小時(shí)，使其與抗NiAb反應(yīng)；
[0210] (4)準(zhǔn)備洗脫液；將木瓜蛋白酶用抑8.0,0.Imol/LTris-HCI緩沖液配制成 lOOng/ml，再加入Immol/L二硫蘇糖醇值TT)37°C解育30min;
[0211] (5)移去酶標(biāo)抗體，用稀釋緩沖液對洗脫液進(jìn)行稀釋，使洗脫液中的木瓜蛋白酶的 濃度與酶標(biāo)抗體的濃度之比為1:80、1:40、1:20、1:10、1:5 (其中每個(gè)濃度作3個(gè)復(fù)孔），分 別放置于37°C溫度下洗脫lh、2h、化；
[0212] (6)移去洗脫液，并用洗漆液進(jìn)行洗漆，待洗漆完成后，加入底物，37°C避光作用 30分鐘；
[0213] (7)將終止液滴加至每一微孔；
[0214] (8)取405皿波長，加完終止液后，將化ISA板置于酶標(biāo)儀上檢測，分別讀取每組 0D值，通過與PBS緩沖液組比較，比較出洗脫液的最適濃度及洗脫時(shí)間，具體結(jié)果參見表4。
[0215] 表4 ;ELISA洗脫液最佳工作濃度及洗脫時(shí)間確定
[0216]
[021引從表4中我們可W發(fā)現(xiàn)，當(dāng)洗脫液中的木瓜蛋白酶的濃度與酶標(biāo)抗體的濃度之比 =1:20時(shí)，各組0D值均低于其他幾