漆完成后，ELISA板于36. 5-37. 5°C放置1-2小時(shí)；
[0108] 4)加待檢樣品，并且溫育；加入步驟2)中的待檢樣品、W已知含量的鑲-纖維蛋 白原馨合物作標(biāo)準(zhǔn)品；用稀釋緩沖液將待檢樣品稀釋至20-80倍，加入微孔中，37°C作用 1-2小時(shí)；
[0109] 5)洗脫；移去待檢樣品，并用洗漆液進(jìn)行洗漆，待洗漆完成后，加入洗脫液，在 37°C下洗脫1-3小時(shí)。
[0110] 6)檢測(cè)；從化ISA板的微孔中取樣，于原子吸收光譜儀檢測(cè)馨合于纖維蛋白原上 的鑲，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，讀出數(shù)值；
[01U] 該方法利用ELISA原理的基礎(chǔ)上結(jié)合原子吸收光譜（AA巧原理，利用原子吸收光 譜儀檢測(cè)馨合于纖維蛋白原上的鑲，由于溶液中僅含有纖維蛋白原，且所用試劑中不含任 何重金屬（陰性對(duì)照組結(jié)果為陰性），不會(huì)對(duì)結(jié)果造成干擾，因而當(dāng)所讀取的結(jié)果顯示為陽(yáng) 性時(shí)，即可證明檢測(cè)出纖維蛋白原上馨合的金屬鑲。
[0112] 立法三^酶聯(lián)免疫與電感禪合等離子體質(zhì)譜結(jié)合法巧LISA法+ICP-MS法）檢測(cè) 鑲-纖維蛋白原馨合物按照如下步驟檢測(cè)：
[0113] 1)將能夠捕獲纖維蛋白原的物質(zhì)，如抗纖維蛋白原抗體（抗FGAb)包被于固相載 體上；用稀釋緩沖液將抗FGAb稀釋至1000-8000倍，加入化ISA板微孔中，4°C過(guò)夜16-18 小時(shí)，或37°C水浴1-3小時(shí)，儲(chǔ)存冰箱；
[0114] 2)從循環(huán)系統(tǒng)取全血，作待檢樣品，lOOOrmp離屯、5-8分鐘，離屯、棄去沉淀；
[0115] 3)封閉；移去稀釋緩沖液，并用洗漆液進(jìn)行洗漆，待洗漆完成后，加入W1% -5% 牛血清白蛋白或脫脂奶粉作為封閉液，37°C放置1小時(shí)，移去封閉液，并用洗漆液進(jìn)行洗 漆，洗漆完成后，ELISA板于36. 5-37. 5°C放置1-2小時(shí)；
[0116] 4)加待檢樣品，并且溫育；加入步驟2)中的待檢樣品、W已知含量的鑲-纖維蛋 白原馨合物作標(biāo)準(zhǔn)品；用稀釋緩沖液將待檢樣品稀釋至20-80倍，加入微孔中，37°C作用 1-2小時(shí)；
[0117] 5)洗脫；移去待檢樣品，并用洗漆液進(jìn)行洗漆，待洗漆完成后，加入洗脫液，在 37°C下洗脫1-3小時(shí)。
[om] 6)酸化；在步驟W中的溶液中加入酸化劑對(duì)溶液進(jìn)行酸化，封口過(guò)夜，徹底酸化， 加入過(guò)氧化氨，并且加熱趕酸；
[0119] 7)檢測(cè)；從步驟6)的化ISA板的溶液中取0.5ml液體，于電感禪合等離子體質(zhì)譜 儀下檢測(cè)馨合于纖維蛋白原的鑲，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，讀出數(shù)值。
[0120] 該方法在利用ELISA原理的基礎(chǔ)上，結(jié)合感禪合等離子體質(zhì)譜（ICP-M巧原理，用 電感禪合等離子體質(zhì)譜儀檢測(cè)馨合于纖維蛋白原上的鑲，由于溶液中僅含有纖維蛋白原， 且所用試劑中不含任何重金屬（陰性對(duì)照組結(jié)果為陰性），不會(huì)對(duì)結(jié)果造成干擾，因而當(dāng)所 讀取的結(jié)果顯示為陽(yáng)性時(shí)，即可證明檢測(cè)出纖維蛋白原上馨合的金屬鑲。
[0121]方法四：提純儀-纖維軍白原謗合物與酶巧免疫結(jié)合法(提純法+ELISA法）檢測(cè) 鑲-纖維蛋白原馨合物，按照如下步驟檢測(cè)：
[0122] 1)從全血中提取纖維蛋白原；采用聚己二醇PEG沉淀法或超速離屯、或分子超濾或 凝膠過(guò)濾等方法從全血提取純化血液中的纖維蛋白原，并將纖維蛋白原復(fù)溶于溶液中，得 到纖維蛋白原溶液；
[0123] 2)將抗NiAb包被于固相載體上；用稀釋緩沖液將抗NiAb稀釋至50000-400000 倍，加入ELISA板微孔中，4°C過(guò)夜16-18小時(shí)，或37°C水浴1-3小時(shí)，儲(chǔ)存冰箱；
[0124] 3)封閉；移去稀釋緩沖液，并用洗漆液進(jìn)行洗漆，待洗漆完成后，加入W1% -5% 牛血清白蛋白或脫脂奶粉作為封閉液，37°C放置1小時(shí)，移去封閉液，并用洗漆液進(jìn)行洗 漆，洗漆完成后，ELISA板于36. 5-37. 5°C放置1-2小時(shí)；
[01巧]4)加待檢樣品，并且溫育；從步驟1)的溶液中取樣，作待檢樣品；W已知含量的 鑲-纖維蛋白原馨合物作標(biāo)準(zhǔn)品；用稀釋緩沖液將待檢樣品稀釋至20-80倍，加入微孔中， 37°C作用1-2小時(shí)；
[0126] 5)酶結(jié)合物溫育：移去步驟4)中的待檢樣品，并用洗漆液進(jìn)行洗漆，待洗漆完 成后，加入用稀釋緩沖液稀釋的酶標(biāo)抗體，使稀釋的酶標(biāo)抗體的濃度為2yg/mL，37°C作用 1-2小時(shí)，使其與酶標(biāo)抗體反應(yīng)；
[0127] 6)底物溫育；移去酶標(biāo)抗體，并用洗漆液進(jìn)行洗漆，待洗漆完成后，加入底物， 37°C避光作用30分鐘；
[0128] 7)終止反應(yīng)；將終止液滴加至每一微孔；
[0129] 8)取波長(zhǎng)405皿，加完終止液后，將化ISA板置于酶標(biāo)儀上檢測(cè)，分別讀取待檢樣 品和標(biāo)準(zhǔn)品的0D值，通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得待檢樣品的含量（也可不使用酶標(biāo)儀，直接通 過(guò)顯色情況進(jìn)行定性檢測(cè)）。
[0130]方法節(jié).；提純儀-纖維蛋白原馨合物與原子吸收光譜結(jié)合法（提純法+AAS法）檢 測(cè)血樣中鑲-纖維蛋白原馨合物，按照如下步驟檢測(cè)：
[0131] 1)從全血中提取纖維蛋白原；采用聚己二醇陽(yáng)G沉淀法或超速離屯、或分子超濾或 凝膠過(guò)濾等方法從全血提取純化血液中的纖維蛋白原，并將纖維蛋白原復(fù)溶于溶液中，得 到纖維蛋白原溶液；
[0132] 2)檢測(cè)；從步驟1)得到的溶液中取樣，于原子吸收光譜儀檢測(cè)馨合于纖維蛋白原 上的鑲，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，讀出數(shù)值。
[0133]方法六：提純縷-纖維蛋白原莖合物與電感禪合等離子體質(zhì)譜結(jié)合法（提純法 +ICP-MS法）檢測(cè)鑲-纖維蛋白原馨合物，按照如下步驟檢測(cè)：
[0134] 1)從全血中提取纖維蛋白原；采用聚己二醇陽(yáng)G沉淀法或超速離屯、或分子超濾或 凝膠過(guò)濾等方法從全血提取純化血液中的纖維蛋白原，并將纖維蛋白原復(fù)溶于溶液中，得 到纖維蛋白原溶液；
[013引。酸化；從步驟1)得到的溶液中取樣，加入酸化劑（如硝酸）對(duì)其進(jìn)行酸化，封 口過(guò)夜，徹底酸化，加入過(guò)氧化氨，并且加熱趕酸；
[0136] 3)檢測(cè)；從步驟2)得到的溶液中取0.5ml液體，于電感禪合等離子體質(zhì)譜儀下檢 測(cè)馨合于纖維蛋白原上的鑲，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，讀出數(shù)值。
[0137]方法走；電泳與酶聯(lián)免疫法或原子吸收光譜法或電感禪合等離子體質(zhì)譜結(jié)合法 (電泳法-ELISA法/AAS法^CP-MS法）檢測(cè)鑲-纖維蛋白原馨合物，按照如下步驟檢測(cè)：
[0138] 1)從全血中提取纖維蛋白原；采用聚己二醇陽(yáng)G沉淀法或超速離屯、或分子超濾或 凝膠過(guò)濾等方法從全血提取純化血液中的纖維蛋白原，并將纖維蛋白原復(fù)溶于溶液中，得 到纖維蛋白原溶液；
[0139] 2)制備膠床；根據(jù)需要選擇瓊脂糖凝膠或聚丙締酷胺凝膠或SDS-聚丙締酷胺凝 膠等作為介質(zhì)，按照常規(guī)方法制備好膠床；
[0140] 3)加樣；取步驟1)得到的溶液中取8yL加入2yL上樣緩沖液，混勻，短暫離屯、； (注意此處步驟不能煮）
[0141] 4)電泳；連接電泳板，進(jìn)行電泳分離；
[014引W檢測(cè)；在膠床上找出含有鑲的蛋白條帶，將該條帶取出，將該蛋白條帶溶于液 體之中，然后再分別利用ELISA或ICP-MS或AAS檢測(cè)溶于液體中的鑲含量。此外，還可W 利用此方法檢測(cè)馨合鑲的纖維蛋白原的等電點(diǎn)、分子量及含量等。
[0143] 方法走中的纖維蛋白原可W用多種方法提純出來(lái)（例如超速離屯、法或高壓液相 層析法或凝膠過(guò)濾層析法或凝膠電泳法或化ISA方法等），將提純出來(lái)的纖維蛋白原復(fù)溶 于溶液中，取一定量的纖維蛋白原，利用電荷移動(dòng)原理，進(jìn)行電泳（electro地oresis，E巧， 在凝膠板（可根據(jù)需要采用不同介質(zhì)）上可根據(jù)分子量、等電點(diǎn)等不同跑出不同的條帶，尋 找出富含鑲的相應(yīng)條帶，將凝膠中的蛋白質(zhì)復(fù)溶于溶液中，即可W在特定波長(zhǎng)下檢測(cè)相關(guān) 纖維蛋白原的含量，也可W利用化ISA或AAS或ICP-MS等原理檢測(cè)出馨合于纖維蛋白原上 的鑲含量，由于溶液中僅含有纖維蛋白原，且所用試劑中不含任何重金屬（陰性對(duì)照組結(jié) 果為陰性），不會(huì)對(duì)結(jié)果造成干擾，因而當(dāng)所讀取的結(jié)果顯示為陽(yáng)性時(shí)，即可證明檢測(cè)出纖 維蛋白原上馨合的金屬鑲。
[0144] 下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說(shuō)明。
[0145] 室施但U;鑲-纖維蛋白原馨合物的制備方法，包括W下步驟：
[0146]A)鑲與纖維蛋白原的馨合反應(yīng)：在人源的纖維蛋白原中加入鑲離子進(jìn)行馨合反 應(yīng)，得到反應(yīng)溶液；
[0147] 試劑配制：
[0148] 1)棚酸鹽緩沖液化01M);稱取0. 31g棚酸溶于400ml超純水中，用0. 1M的化0H 調(diào)節(jié)抑至9. 0,定容至500血。
[0149] 2)纖維蛋白原溶液；稱取4.Omg纖維蛋白原溶于4. 0血0. 01MpH9. 0棚酸鹽緩沖 液中，充分振蕩溶解，配制成1.Omg/mL的蛋白溶液；
[0150] 3化DTA-NaHC〇3混合溶液；稱取邸TA? 2H2〇 1. 86g、NaHC〇316. 8g溶于 900血超純 水中，用l.OM化OH調(diào)整抑至8.0定容至1000ml，高壓滅菌，室溫保存；
[0151] 4HTC邸購(gòu)買(mǎi)自日本同仁化學(xué)研究所，貨號(hào)為M030;
[0152] 5)透析袋購(gòu)自BioshopInc,截留分子量14000。
[0153] 鑲-纖維蛋白原馨合物的馨合步驟：
[0154] 1)透析袋的處理；將透析袋放入500ml的邸TA-NaHC〇3混合溶液中，煮沸l(wèi)Omin; 傾棄邸TA/NaHC〇3液，用超純水輕輕漂洗，再用500ml的5mmol/L邸TA溶液煮沸l(wèi)Omin;棄 掉煮沸液，用超純水徹底清洗，加入超純水浸泡透析袋4°C過(guò)夜。使用時(shí)，戴上手套，取出透 析袋，用超純水徹底沖洗其內(nèi)外表面；
[0巧引2)取2.OmgITC邸溶于2mlDMS0中；
[0156] 3)取4.Omg纖維蛋白原溶于4. 0ml棚酸鹽緩沖溶液中；
[0157] 4)緩慢將步驟2)配制的液體加入步驟3)配制的纖維蛋白原溶液中，邊滴加邊震 蕩，置于溫度為25°C，轉(zhuǎn)速為10化/min的搖床中反應(yīng)2化，然后用透析袋透析2化，除去未與 纖維蛋白原結(jié)合的ITCBE;
[0158] 5)將步驟4)所得的液體用Imol/L肥1調(diào)節(jié)抑值至7