賦予玉蜀黍?qū)τ衩赘xIl的抗性的組合物和方法
【專利說(shuō)明】賦予玉蜀黍?qū)τ衩赘x丨丨的抗性的組合物和方法
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002] 本申請(qǐng)要求2012年9月20日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)No. 61/703,396、2013年3 月14日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)No. 61/781，057、2012年9月20日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng) No. 61/703, 414以及2013年3月14日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)No. 61/781，124的權(quán)益，它們的 整個(gè)內(nèi)容以引用方式并入本文。
[0003] 對(duì)序列表的引用
[0004] 依據(jù)美國(guó)專利法施行細(xì)則（C.F.R.)第37篇第1. 52條（e)項(xiàng)（5)款將2013年9 月20日作為文本文件提交的序列表?yè)?jù)此以引用方式并入，該文本文件名稱為"BB2190PCT_ Sequence_Listing"，創(chuàng)建日期為2013年9月20日，文件大小為151，366字節(jié)。
技術(shù)領(lǐng)域
[0005] 本發(fā)明的領(lǐng)域涉及植物育種和遺傳學(xué)，具體地講，涉及可用于玉蜀黍植物以賦予 對(duì)玉米根蟲的抗性的重組DNA構(gòu)建體。
【背景技術(shù)】
[0006] 葉甲屬（Diabrotica)甲蟲的三個(gè)種-西部玉米根蟲（Diabroticavirgifera virgiferaLeConte)、北部玉米根蟲（DiabroticabarberiSmith和Diabroticabarberi Lawrence)和南部玉米根蟲（DiabroticaundecimpunctatahowardiBarber)的幼蟲形態(tài) 是美國(guó)中西部危害嚴(yán)重的玉米昆蟲害蟲的代表。大約有三千萬(wàn)英畝（120, 000km2)的玉米 (種植面積八千萬(wàn)英畝）受到玉米根蟲感染，據(jù)美國(guó)農(nóng)業(yè)部估計(jì)，玉米根蟲的幼蟲每年可能 造成大約10億美元的損失。
[0007] 存在多種旨在防治玉米根蟲的不同治理實(shí)踐，包括選擇玉米品種、提前播種、施用 殺蟲劑、輪作和使用轉(zhuǎn)基因玉米品種；然而，這些實(shí)踐憑其自身均未證實(shí)能有效地治理害 蟲。還存在另外的復(fù)雜情況，原因在于玉米根蟲已顯示出能夠進(jìn)化出對(duì)數(shù)種防治措施（包 括施用殺蟲劑、改進(jìn)栽培技術(shù)和向植物中引入抗性基因）的抗性的驚人能力。
[0008] 因此，一直需要可結(jié)合到昆蟲害蟲綜合治理策略中的使玉蜀黍產(chǎn)生玉米根蟲抗性 的新機(jī)理。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明提供了其中使編碼CRW2的多核苷酸在玉蜀黍植物中表達(dá)的增強(qiáng)玉蜀黍植 物對(duì)昆蟲害蟲植食性的抗性的方法。此外，本發(fā)明提供了其中使編碼CRW1和CRW2的多核 苷酸在玉蜀黍植物中表達(dá)的增強(qiáng)玉蜀黍植物對(duì)昆蟲害蟲植食性的抗性的方法。
[0010] 本發(fā)明還提供了鑒定賦予玉蜀黍植物對(duì)昆蟲害蟲植食性的增強(qiáng)抗性的 ZmCrw2(或ZmCRW2)變體隨后進(jìn)一步將所述變體引入玉蜀黍植物中的方法。所述變體可以 通過(guò)基因改組實(shí)驗(yàn)鑒定，或者可以是通過(guò)連鎖繪圖或全基因組關(guān)聯(lián)分析鑒定的天然存在的 等位基因變體。由基因改組得到的變體能夠以轉(zhuǎn)基因方式引入玉蜀黍植物從而賦予它們?cè)?強(qiáng)的抗性，而使用本文所示方法鑒定的等位基因變體可利用分子育種技術(shù)摻入玉蜀黍植物 中。
[0011] 在一些實(shí)施例中，昆蟲害蟲為鞘翅目（Coleopteran)昆蟲。
[0012] 在其他實(shí)施例中，鞘翅目昆蟲害蟲屬于葉甲屬。在另有其他實(shí)施例中，昆蟲害蟲為 玉米根蟲，包括但不限于西部玉米根蟲、北部玉米根蟲和/或南部玉米根蟲。
[0013] 在其他實(shí)施例中，鞘翅目昆蟲害蟲屬于弧麗金龜屬（Popillia)，并且昆蟲害蟲為 日本金龜子。
[0014] 在一些實(shí)施例中，昆蟲害蟲為鱗翅目（L印idopteran)昆蟲。鱗翅目昆蟲害 蟲可以是歐洲玉米螟（Ostriniasp.)、美國(guó)白蛾（Hyphantriacunea)或cattail caterpillar(Simyrainsularis)〇
[0015] 本發(fā)明還提供了隔離的多核苷酸或cDNA、含有所述多核苷酸的重組構(gòu)建體，以及 含有所述重組構(gòu)建體的植物及植物細(xì)胞。
[0016] 附圖和序列表簡(jiǎn)述
[0017] 由以下的"【具體實(shí)施方式】"及構(gòu)成本申請(qǐng)一部分的附圖和序列表可以更完全地理 解本發(fā)明。
[0018] 圖1A-圖1G示出ZmCrw2與crw2_Mutag突變等位基因之間的比對(duì)。
[0019] 圖2A-圖2F示出ZmCrw2與crw2-EMS突變等位基因之間的比對(duì)。
[0020] 圖3示出玉蜀黍同聚半乳糖醛酸1(HGA1)基因（也稱為糖基轉(zhuǎn)移酶AER61或 ZmCrw2)的結(jié)構(gòu)。示出了兩個(gè)增變基因插入和EMS等位基因的位置。
[0021] 圖 4A-圖 4J示出ZmCrw2 蛋白（SEQIDN0 :2)及其同源物（SEQIDN0 :7、8、9、10、 11、12、13、14、15、16、17、18、20、22 和 23)的比對(duì)。
[0022] 圖5示出圖4A-圖4J中顯示的多肽的每對(duì)氨基酸序列的序列同一性百分比和趨 異度值。
[0023] 圖6(A)示出crw2_Mutag突變等位基因在10天大的幼苗中的基因表達(dá)。從葉、莖 和根組織采集了總RNA樣品，隨后使用基因特異性引物執(zhí)行了RT-PCR分析。crw2-Mutag突 變體在三種組織中顯示差異表達(dá)，其轉(zhuǎn)錄物比野生型近親中的轉(zhuǎn)錄物長(zhǎng)145bp。圖6(B)示 出crw2-TUSC突變體與其野生型近親相比的RT-PCR分析結(jié)果。在該圖中，"-1"和"_2"是 指測(cè)試了每個(gè)等位基因的兩份獨(dú)立的樣品。
[0024] 圖7示出從Lynx數(shù)據(jù)庫(kù)收集的ZmCrw2基因在不同植物組織中的表達(dá)。
[0025] 圖8示出在西部玉米根蟲攝食后的各時(shí)間點(diǎn)Crwl突變體與其野生型中的Crw2轉(zhuǎn) 錄物水平的對(duì)比。在西部玉米根蟲攝食的45分鐘內(nèi)，野生型植物中的Crw2轉(zhuǎn)錄物水平快 速上調(diào)（上圖）。在西部玉米根蟲攝食后未在Crwl突變體中觀察到這種上調(diào)（下圖）。用 相同方案上樣的18SrRNA對(duì)照的結(jié)果在B中示出。
[0026] 圖9示出ZmCrwl和ZmCrw2在對(duì)西部玉米根蟲植食性易感的雙單倍體株系中的表 達(dá)（使用RT-PCR分析進(jìn)行評(píng)估）。結(jié)果表明ZmCrwll在該雙單倍體株系中表達(dá)，而ZmCrw2 不表達(dá)（圖9)。
[0027] 圖10A和圖10B示出在成株期期間，與野生型（"WT"）相比，Crw2突變體（"MT"） 具有（A)較低水平的細(xì)胞壁結(jié)合的對(duì)香豆酸（pCA)和阿魏酸（FA)，以及⑶較低水平的木 質(zhì)素（P < 〇. 05 ;非配對(duì)t檢驗(yàn)）。
[0028] SEQIDNO:1是野生型玉米（Zeamays)Crw2(ZmCrw2)cDNA的編碼區(qū)的核苷酸序 列。
[0029] SEQIDNO:2是野生型玉米CRW2 (ZmCRW2)蛋白的氨基酸序列，所述蛋白也稱為糖 基轉(zhuǎn)移酶（UniProt登錄號(hào)B6TY42)。
[0030] SEQIDN0 :3是突變crw2_Mutag等位基因的cDNA的核苷酸序列。
[0031] SEQIDN0:4是由突變crw2-Mutag等位基因編碼的多肽的氨基酸序列。
[0032] SEQIDN0 :5是突變crw2-EMS等位基因的cDNA的核苷酸序列。
[0033] SEQIDN0:6是由突變crw2-EMS等位基因編碼的多肽的氨基酸序列。
[0034] SEQIDN0:7是玉米的推定非典型蛋白（UniProt登錄號(hào)C0H)R7)的氨基酸序列。
[0035] SEQIDN0:8是玉米的推定非典型蛋白（UniProt登錄號(hào)C4J6G0)的氨基酸序列。
[0036] SEQIDN0 :9 是水稻（Oryzasativa)的推定HGA1 (標(biāo)識(shí)符 0s06g49320;UniProt 登錄號(hào)Q5Z8T7)的氨基酸序列。
[0037] SEQIDN0 :10 是水稻的推定HGA1 (標(biāo)識(shí)符 0s02g0135500;UniProt登錄號(hào) Q6Z0Z4)的氨基酸序列。
[0038] SEQIDN0 :11是高粱（Sorghumbicolor)的推定非典型蛋白 Sbl0g029380 (UniProt登錄號(hào)C5Z9B2)的氨基酸序列。
[0039] SEQIDN0 :12是高粱的推定非典型蛋白Sb04g002850 (UniProt登錄號(hào)C5XTX5)的 氨基酸序列。
[0040] SEQIDN0 :13是大豆（Glycmemax)非典型蛋白（標(biāo)識(shí)符Glyma〇5g3417〇;UniProt 登錄號(hào)I1K5F9)的氨基酸序列。
[0041] SEQIDN0 :14是大豆非典型蛋白（標(biāo)識(shí)符Glyma08G05490 ;UniProt登錄號(hào) I1KQG2)的氨基酸序列。
[0042] SEQIDN0 :15 是擬南芥（Arabidopsisthaliana)糖基轉(zhuǎn)移酶家族 61 蛋白（TAIR 標(biāo)識(shí)符：At3gl8170;NCBIG1No.GI30684813)的氨基酸序列。
[0043] SEQIDN0 :16是也稱為糖基轉(zhuǎn)移酶家族61蛋白的擬南芥At3gl8180基因座 (UniProt登錄號(hào)Q9LV22)的氨基酸序列。
[0044] SEQIDN0 :17 是大麥（Hordeumvulgare)預(yù)測(cè)蛋白（UniProt登錄號(hào)F2DBB4)的 氨基酸序列。
[0045] SEQIDN0 :18 是也稱為BRADIlG：M67〇 的二穗短柄草（Brachypodium distachyon)非典型蛋白（UniProt登錄號(hào)I1GVW1)的氨基酸序列。
[0046] SEQIDN0 :19是得自百喜草（Paspalumnotatum)的ZmCrw2的同源物（在內(nèi)部 專有數(shù)據(jù)庫(kù)中辨認(rèn)出來(lái)，在本文中稱為PnCrw2)的核苷酸序列。
[0047] SEQIDN0 :20是由SEQIDN0 :19編碼的多肽的氨基酸序列。該多肽在本文稱作 PnCRW2〇
[0048] SEQIDNO:21 是得自畫眉草（Eragrostisnindensis)的ZmCrw2 的同源物（在 內(nèi)部專有數(shù)據(jù)庫(kù)中辨認(rèn)出來(lái)，在本文中稱為EnCrw2)的核苷酸序列。
[0049] SEQIDN0 :22是由SEQIDN0 :21編碼的多肽的氨基酸序列。該多肽在本文稱作 EnCRW2〇
[0050] SEQIDNO:23得自大豆的非典型糖基轉(zhuǎn)移酶AG061樣蛋白（NCBIG1 No. 356511269)的氨基酸序列。
[0051] SEQIDNO:24是用于RT-PCR分析的正向基因特異性引物PHN151293的核苷酸序 列。
[0052] SEQIDN0 :25是用于RT-PCR分析的反向基因特異性引物PHN151298的核苷酸序 列。
[0053] SEQIDN0:26是野生型玉米CRWl(ZmCRWl)蛋白的氨基酸序列。
[0054] SEQIDN0 :27是得自水稻的次生壁NAC轉(zhuǎn)錄因子2 (UniProt登錄號(hào)G3M8D2)的 氨基酸序列。
[0055] SEQIDN0 :28 是得自水稻的推定NAM蛋白（0sNAC7)(標(biāo)識(shí)符 0s06g04090. 1 ; UniProt登錄號(hào)Q9SNM6)的氨基酸序列。
[0056] SEQIDN0 :29是得自高粱的推定非典型蛋白（標(biāo)識(shí)符Sb07g001550. 1;UniProt 登錄號(hào)C5YM23)的氨基酸序列。
[0057] SEQIDN0 :30是得自高粱的推定NAM蛋白（標(biāo)識(shí)符Sbl0g002120. 1 ;UniProt登 錄號(hào)Q5NKS7)的氨基酸序列。
[0058] SEQIDN0 :31是得自大豆的非典型蛋白（標(biāo)識(shí)符Glymal6g02200. 1 ;UniProt登 錄號(hào)I1MKD6)的氨基酸序列。
[0059] SEQIDN0 :32是得自大豆的非典型蛋白（標(biāo)識(shí)符Glyma07g05660. 1 ;UniProt登 錄號(hào)I1KHQ4)的氨基酸序列。
[0060] SEQIDN0 :33是得自擬南芥的含NAC結(jié)構(gòu)域蛋白43 (標(biāo)識(shí)符At2g46770. 1 ; UniProt登錄號(hào)Q84WP6)的氨基酸序列。
[0061] SEQIDN0 :34是得自擬南芥的含NAC結(jié)構(gòu)域蛋白12 (標(biāo)識(shí)符Atlg32770. 1 ; UniProt登錄號(hào)Q9LPI7)的氨基酸序列。
[0062] SEQIDN0 :35是得自擬南芥的含NAC結(jié)構(gòu)域蛋白66 (標(biāo)識(shí)符At3g61910. 1 ; UniProt登錄號(hào)Q9M274)的氨基酸序列。
[0063] 3￡〇10勵(lì)：36是得自玉米的次生壁嫩(：轉(zhuǎn)錄因子2(1]111?仰七登錄號(hào)財(cái)??35)的 氨基酸序列。
[0064] SEQIDN0 :37是得自玉米的推定NAM蛋白（UniProt登錄號(hào)Q5NKQ3)的氨基酸序 列。
[0065] SEQIDN0 :38是得自二穗短柄草的CRW1同源物（NCBIG1No. 357139497,在本文 中稱為BdCRWl)的氨基酸序列。
[0066] SEQIDN0 :39是得自葡萄（Vitisvinifera)的推定非典型蛋白（UniProt登錄 號(hào)F6HU82)的氨基酸序列。
[0067] SEQIDN0 :40是得自大豆的CRW1同源物（NCBIG1No. 356522480,在本文中稱為 GmCRWl)的氨基酸序列。
[0068] SEQIDN0 :41是得自陸地棉（Gossypiumhirsutum)的含NAC結(jié)構(gòu)域蛋白 (UniProt登錄號(hào)G4V2G0)的氨基酸序列。
[0069] SEQIDN0 :42是得自蘋果（Pyrusmalus)的NAC結(jié)構(gòu)域類轉(zhuǎn)錄因子（NAC12) (UniProt登錄號(hào)D9ZJ90)的氨基酸序列。
[0070] SEQIDN0:43是得自大麥的預(yù)測(cè)蛋白（UniProt登錄號(hào)F2DV83)的氨基酸序列。
[0071] SEQIDNO:44 是得自擬南芥的CRW1 同源物（NCBIG1No. 3510262;UniProt登錄 號(hào)Q84WP6)的氨基酸序列。
[0072] 本申請(qǐng)隨附的序列說(shuō)明和序列表符合美國(guó)專利法施行細(xì)則第37篇第1. 821條和 第1. 825條中關(guān)于專利申請(qǐng)中的核苷酸和/或氨基酸序列公開(kāi)內(nèi)容的指導(dǎo)規(guī)則。
[0073] 序列表含有對(duì)于核苷酸序列字符的單字母編碼和對(duì)于氨基酸的三字母編碼， 所述編碼如遵照在NucleicAcidsRes.l3:30213030(1985)(《核酸研究》，第13卷，第 3021-3030頁(yè)，1985年）和 BiochemicalJ. 219 (No. 2) :345373 (1984)(《生物化學(xué)雜志》， 第219卷第2期，第345-373頁(yè)，1984年）中記述的IUPACIUBMB標(biāo)準(zhǔn)所定義，這兩份文獻(xiàn) 以引用方式并入本文。用于核苷酸和氨基酸序列數(shù)據(jù)的符號(hào)和格式遵守美國(guó)專利法施行細(xì) 則第37篇第1. 822條中示出的規(guī)則。
【具體實(shí)施方式】
[0074] 本文給出的每份參考文獻(xiàn)的公開(kāi)內(nèi)容據(jù)此全文引入以供參考。
[0075] 本文中和隨附的權(quán)利要求書中所用名詞形式上為單數(shù)，但包括復(fù)數(shù)指代，除非上 下文清楚表明并非如此。因此，例如，提及"一株植物"包括多株此類植物，提及"一個(gè)細(xì)胞" 包括一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其等同物，等等。
[0076] 如本文所用：
[0077] 術(shù)語(yǔ)"單子葉植物"和"單子葉的植物"在本文中可互換使用。
[0078] 術(shù)語(yǔ)"雙子葉植物"和"雙子葉的植物"在本文中可互換使用。
[0079] 術(shù)語(yǔ)"完全互補(bǔ)序列"和"全長(zhǎng)互補(bǔ)序列"在本文中可互換使用，是指給定核苷酸 序列的互補(bǔ)序列，其中所述互補(bǔ)序列和所述核苷酸序列由相同數(shù)量的核苷酸組成并且是 100 %互補(bǔ)的。
[0080] "表達(dá)序列標(biāo)簽"（"EST"）是源自CDNA文庫(kù)的DNA序列，因而是已轉(zhuǎn)錄的序列。 EST通常通過(guò)對(duì)cDNA插入片段進(jìn)行單向測(cè)序獲得。整個(gè)cDNA插入片段的序列稱為"全長(zhǎng) 插入序列"（"FIS"）。"重疊群"序列是由可選自但不限于EST、FIS和PCR序列的兩個(gè)或更 多個(gè)序列裝配成的序列。將編碼完整或功能性蛋白的序列稱為"完全基因序列"（"CGS"）， 該序列可能源自FIS或重疊群。
[0081] "性狀"是指植物或特定植物材料或細(xì)胞的生理學(xué)、形態(tài)學(xué)、生物化學(xué)、或物理學(xué)特 征。在某些情況下，這種特征是人眼可見(jiàn)的，例如種子或植物大小，或者可通過(guò)以下方式測(cè) 量：應(yīng)用生物化學(xué)技術(shù)，例如檢測(cè)種