子或葉的蛋白質(zhì)、淀粉、或油含量；觀察代謝或生理過 程，如通過測量缺水耐受性或者對特定鹽或糖濃度的耐受性；觀察一個或多個基因的表達 水平；進行農(nóng)學(xué)觀察，例如觀察滲透脅迫耐受性或產(chǎn)量。
[0082] "轉(zhuǎn)基因"是指其基因組因異源核酸（比如重組DNA構(gòu)建體）的存在而發(fā)生改變的 任何細胞、細胞系、愈傷組織、組織、植物部分或植物，包括那些最初的轉(zhuǎn)基因事件以及從最 初的轉(zhuǎn)基因事件通過有性雜交或無性生殖產(chǎn)生的那些。如本文所用的術(shù)語"轉(zhuǎn)基因（的）" 不涵蓋通過常規(guī)植物育種方法或通過諸如隨機異花受精、非重組病毒感染、非重組細菌轉(zhuǎn) 化、非重組轉(zhuǎn)座或自發(fā)突變之類的自然發(fā)生事件導(dǎo)致的基因組（染色體基因組或染色體外 基因組）改變。
[0083] "基因組"在用于植物細胞時不僅涵蓋存在于細胞核中的染色體DNA，而且還包括 存在于細胞的亞細胞組分（例如線粒體、質(zhì)體）中的細胞器DNA。
[0084] 提及"植物"包括提及整個植株、植物器官、植物組織、植物繁殖體、種子和植物細 胞以及同一植株的子代。
[0085] 植物細胞包括但不限于得自下列物質(zhì)的細胞：種子、懸浮培養(yǎng)物、胚、分生組織區(qū)、 愈傷組織、葉、根、芽、配子體、孢子體、花粉和小孢子。
[0086] "子代"包括植物的任何后續(xù)世代。
[0087] "轉(zhuǎn)基因植物"包括在其基因組內(nèi)包含異源多核苷酸的植物。例如，異源多核苷酸 穩(wěn)定地整合在基因組內(nèi)，使得該多核苷酸得以傳遞至連續(xù)的世代。異源多核苷酸可單獨地 或作為重組DNA構(gòu)建體的一部分整合進基因組中。
[0088] 遺傳改良種質(zhì)的商業(yè)開發(fā)也已進展到將多種性狀引入農(nóng)作物植物的階段，常稱為 基因堆疊方法（genestackingapproach)。在該方法中，可以將賦予不同所關(guān)注特性的多 個基因引入植物。基因堆疊可通過許多方法實現(xiàn)，包括但不限于共轉(zhuǎn)化、再轉(zhuǎn)化以及具有不 同轉(zhuǎn)基因的株系的雜交。
[0089] "轉(zhuǎn)基因植物"還包括在其基因組內(nèi)包含不止一種異源多核苷酸的植物。每種異源 多核苷酸可賦予轉(zhuǎn)基因植物不同的性狀。
[0090] 針對序列而言的"異源"意指源自外來物種的序列，或者如果源自相同物種，則指 通過蓄意的人為干預(yù)而從其天然形式發(fā)生了組成和/或基因座的顯著改變的序列。
[0091] "多核苷酸"、"核酸序列"、"核苷酸序列"或"核酸片段"可互換使用，并且是任選地 含有合成的、非天然的或改變的核苷酸堿基的單鏈或雙鏈RNA或DNA聚合物。核苷酸（通 常以它們的5'單磷酸鹽形式存在）用它們的單字母名稱指代如下："A"表示腺苷酸或脫氧 腺苷酸（分別對應(yīng)RNA或DNA)，"C"表示胞苷酸或脫氧胞苷酸，"G"表示鳥苷酸或脫氧鳥苷 酸，"U"表示尿苷酸，"T"表示脫氧胸苷酸，"R"表示嘌呤（A或G)，"Y"表示嘧啶（C或T)， "K"表示G或T，"H"表示A或C或T，"I"表示肌苷，"N"表示任意核苷酸。
[0092] "多肽"、"肽"、"氨基酸序列"和"蛋白（質(zhì)）"在本文中可互換使用，是指氨基酸殘 基的聚合物。這些術(shù)語適用于其中一個或多個氨基酸殘基是相應(yīng)的天然存在的氨基酸的人 工化學(xué)類似物的氨基酸聚合物，以及適用于天然存在的氨基酸聚合物。術(shù)語"多肽"、"肽"、 "氨基酸序列"和"蛋白（質(zhì)）"還可包括修飾，包括但不限于糖基化、脂質(zhì)連接、硫酸鹽化、 谷氨酸殘基的y-羧化、羥化和ADP-核糖基化。
[0093] "信使RNA(mRNA) "是指無內(nèi)含子并且可由細胞翻譯成蛋白質(zhì)的RNA。
[0094] "cDNA"是指與mRNA模板互補并且利用逆轉(zhuǎn)錄酶從mRNA模板合成的DNA。cDNA可 以是單鏈的，或者可以用DNA聚合酶I的Klenow片段轉(zhuǎn)化成雙鏈形式。
[0095] "編碼區(qū)"是指編碼蛋白質(zhì)或多肽的信使RNA部分（或另一核酸分子諸如DNA分子 的對應(yīng)部分）。"非編碼區(qū)"是指信使RNA或其他核酸分子并非編碼區(qū)的所有部分，包括但 不限于（例如）啟動子區(qū)、5'非翻譯區(qū)（"UTR"）、3'UTR、內(nèi)含子和終止子。術(shù)語"編碼 區(qū)"和"編碼序列"在本文中可互換使用。術(shù)語"非編碼區(qū)"和"非編碼序列"在本文中可互 換使用。
[0096] "成熟"蛋白是指經(jīng)翻譯后加工的多肽；S卩，已經(jīng)去除了存在于初級翻譯產(chǎn)物中的 任何前肽或原肽的多肽。
[0097] "前體"蛋白是指mRNA的翻譯初級產(chǎn)物；S卩，具有仍然存在的前肽和原肽。前肽和 原肽可以是并且不限于細胞內(nèi)定位信號。
[0098] "隔離的"是指物質(zhì)，諸如核酸分子和/或蛋白，該物質(zhì)基本上不含在天然存在的環(huán) 境中通常伴隨該物質(zhì)或與其反應(yīng)的組分，或者說是該物質(zhì)從所述組分移出。隔離的多核苷 酸可從它們天然存在于其中的宿主細胞純化。技術(shù)人員已知的常規(guī)核酸純化方法可用于獲 得隔離的多核苷酸。該術(shù)語也涵蓋重組多核苷酸和化學(xué)合成的多核苷酸。
[0099] "重組體"是指例如通過化學(xué)合成或通過用基因工程技術(shù)操縱隔離的核酸片段而 實現(xiàn)的兩個原本隔離的序列片段的人工組合。"重組體"也包括提及已經(jīng)通過引入異源核酸 而進行了修飾的細胞或載體，或源于經(jīng)這樣修飾的細胞的細胞，但不涵蓋由天然發(fā)生的事 件（例如自發(fā)突變、自然轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)導(dǎo)/轉(zhuǎn)座）對細胞或載體的改變，諸如沒有蓄意的人為干 預(yù)而發(fā)生的那些。
[0100] "重組DNA構(gòu)建體"是指在自然界中通常不會一起存在的核酸片段的組合。因此， 重組DNA構(gòu)建體可包含源于不同來源的調(diào)控序列和編碼序列，或源于相同來源但以不同于 通常天然存在的方式排列的調(diào)控序列和編碼序列。
[0101] 術(shù)語"入門克隆"和"入門載體"在本文中可互換使用。
[0102] "調(diào)控序列"是指位于編碼序列上游（5'非編碼序列）、中間或下游（3'非編碼序 列）并影響相關(guān)編碼序列的轉(zhuǎn)錄、RNA加工或穩(wěn)定性或者翻譯的核苷酸序列。調(diào)控序列可 包括但不限于啟動子、翻譯前導(dǎo)序列、內(nèi)含子和多腺苷酸化識別序列。術(shù)語"調(diào)控序列"和 "調(diào)控元件"在本文中可互換使用。
[0103] "啟動子"是指能夠控制另一核酸片段轉(zhuǎn)錄的核酸片段。
[0104] 在多數(shù)情況下引起基因在大多數(shù)細胞型中表達的啟動子通常稱為"組成型啟動 子"。
[0105] "在植物中有功能的啟動子"是能夠控制植物細胞中的轉(zhuǎn)錄的啟動子，無論其是否 來源于植物細胞。
[0106] "組織特異性啟動子"和"組織優(yōu)選啟動子"可互換使用，并指主要但非必須專一地 在一種組織或器官中表達，而是也可以在一種特定細胞中表達的啟動子。
[0107] "發(fā)育調(diào)控啟動子"是指其活性由發(fā)育事件決定的啟動子。
[0108] "有效連接"是指核酸片段連接成單一片段，使得其中一個核酸片段的功能受到另 一個核酸片段的調(diào)控。例如，在啟動子能夠調(diào)控核酸片段的轉(zhuǎn)錄時，該啟動子與該核酸片段 有效地連接。
[0109] "表達"是指功能產(chǎn)物的產(chǎn)生。例如，核酸片段的表達可以指核酸片段的轉(zhuǎn)錄（例 如，生成mRNA或功能性RNA的轉(zhuǎn)錄）和/或mRNA翻譯成前體或成熟蛋白。
[0110] "過表達"是指基因產(chǎn)物在轉(zhuǎn)基因生物體中的生產(chǎn)超過在來自相同實驗的無效分 離（nullsegregating)(或非轉(zhuǎn)基因）生物體中的生產(chǎn)水平。
[0111] "表型"意指細胞或生物體的可檢測的特征。
[0112] 在將核酸片段（例如，重組DNA構(gòu)建體）插入細胞的語境中，"引入"意指"轉(zhuǎn)染" 或"轉(zhuǎn)化"或"轉(zhuǎn)導(dǎo)"，并且包括提及將核酸片段摻入到真核或原核細胞中，其中該核酸片段 可摻入到細胞的基因組（例如染色體、質(zhì)粒、質(zhì)體或線粒體DNA)中，轉(zhuǎn)化成自主復(fù)制子、或 瞬時表達（例如，轉(zhuǎn)染的mRNA)。
[0113] "轉(zhuǎn)化的細胞"是已將核酸片段（例如，重組DNA構(gòu)建體）引入其中的任何細胞。
[0114] 在此所用的"轉(zhuǎn)化"指穩(wěn)定轉(zhuǎn)化和瞬時轉(zhuǎn)化兩者。
[0115] "穩(wěn)定轉(zhuǎn)化"是指將核酸片段引入宿主生物體的基因組中，導(dǎo)致基因穩(wěn)定遺傳。一旦穩(wěn)定轉(zhuǎn)化，核酸片段便穩(wěn)定地整合進宿主生物體和任何后續(xù)世代的基因組中。
[0116] "瞬時轉(zhuǎn)化"是指將核酸片段引入宿主生物體的細胞核中或包含DNA的細胞器中， 引起基因表達但無基因穩(wěn)定遺傳。
[0117] 術(shù)語"雜交的"或"雜交"意指經(jīng)由授粉產(chǎn)生子代（例如細胞、種子或植物）的配子 融合。該術(shù)語既涵蓋有性雜交（一株植物被另一株植物授粉），也涵蓋自交（自花授粉，例 如當(dāng)花粉和胚珠來自相同植物時）。術(shù)語"雜交"是指經(jīng)由授粉產(chǎn)生子代的配子融合行為。
[0118] 術(shù)語"基因座"一般是指攜帶一種基因，或可能兩種或更多種基因的染色體的遺傳 限定區(qū)域，所述基因如此緊密連鎖而使得它們在遺傳上表現(xiàn)為負責(zé)表型的單個基因座。當(dāng) 在本文中結(jié)合ZmCrw2使用時，"ZmCrw2基因座"應(yīng)指攜帶ZmCrw2基因的染色體的限定區(qū) 域，包括其相關(guān)調(diào)控序列。相似地，當(dāng)在本文中結(jié)合ZmCrwl使用時，"ZmCrwl基因座"應(yīng)指 攜帶ZmCrwl基因的染色體的限定區(qū)域，包括其相關(guān)調(diào)控序列。
[0119] "基因"應(yīng)指基因座內(nèi)的特定基因編碼區(qū)，包括其相關(guān)調(diào)控序列。本領(lǐng)域的普通技 術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，相關(guān)調(diào)控序列將距Zmcrw2編碼序列不到約4kb的距離，且啟動子位于上 游。
[0120] "等位基因"是基因的占據(jù)染色體上特定基因座的幾種可選形式之一。當(dāng)二倍體植 物中的一對同源染色體上特定基因座處存在的等位基因相同時，該植物在該基因座處是純 合的。如果二倍體植物中的一對同源染色體上特定基因座處存在的等位基因不同，則該植 物在該基因座處是雜合的。如果二倍體植物中的一對同源染色體之一上存在轉(zhuǎn)基因，則該 植物在該基因座處是半合子的。
[0121] "有利等位基因"是位于特定基因座、賦予或有助于所期望的表型的等位基因，或 作為另一種選擇，是允許鑒定不具有所期望表型的植物以使得可將所述植物從育種計劃或 種植中篩除的等位基因。標(biāo)記的有利等位基因是與有利表型分離、或作為另一種選擇與不 利植物表型分離從而提供鑒定植物的有益效果的標(biāo)記等位基因。
[0122] "種質(zhì)"是指個體（例如，一株植物）、個體組（例如，一個植物株系、品種或科）或 者源自一個株系、品種、物種或培養(yǎng)物的克隆的遺傳物質(zhì)或源自它們的遺傳物質(zhì)。種質(zhì)可 以是生物體或細胞的一部分，或可以從生物體或細胞分離得到。通常，種質(zhì)提供具有特異分 子組成的遺傳物質(zhì)，該特異分子組成為生物體或細胞培養(yǎng)物的部分或全部的遺傳特性提供 物質(zhì)基礎(chǔ)。如本文所用，種質(zhì)包括細胞、種子或組織（可以由它們長出新植株）或者可以培 養(yǎng)出整個植株的植物部分，例如葉、莖、花粉或細胞。
[0123] 序列比對和同一性百分數(shù)計算可以用多種被設(shè)計用于檢測同源序列的比較方法 來確定，包括但不限于lasergene'k.生物信息學(xué)計算軟件包（美國威斯康星州麥迪遜 市DNASTAR有限公司（DNASTAR*Inc.，Madison，Wl))的Megalign?瑕序。除非另行 指出，否則本文提供的序列的多重比對均使用ClustalW比對方法進行。
[0124] ClustalW比對方法（由HigginsandSharp，CABI0S. 5 :151-153 (1989)(Higgins 和Sharp，《計算機在生物科學(xué)中的應(yīng)用》，第5卷第151-153頁，1989年）；Higgins，D.G.et al.，Comput.Appl.Biosci. 8 :189-191 (1992) (Higgins，D.G?等人，《計算機在生物科學(xué)中的 應(yīng)用》，第8卷第189-191頁，1992年）描述）可見于LASERGENEK:生物信息學(xué)計算軟 件包（美國威斯康星州麥迪遜市DNASTAR有限公司（DNASTAR@Inc.，Madison，Wis.)) 的MegAlign?V6. 1程序。用于多重比對的默認參數(shù)對應(yīng)于空位罰分=10、空位長度罰分= 0. 2、延遲發(fā)散序列=30%、DNA轉(zhuǎn)換權(quán)重=0. 5、蛋白質(zhì)權(quán)重矩陣=Gonnet系列、DNA權(quán)重 矩陣=IUB。就雙序列比對而言，默認參數(shù)為比對=緩慢-準確（Slow-Accurate)、空位罰 分=10. 0、空位長度=0? 10、蛋白質(zhì)權(quán)重矩陣=Gonnet250、DNA權(quán)重矩陣=IUB。
[0125] 在使用ClustalW程序進行序列比對后，可以通過觀察同一程序中的"序列距離" 表來獲得"同一性百分數(shù)"和"趨異度"值；除非另行指出，否則本文提供并受權(quán)利要求書保 護的同一性百分數(shù)和趨異度以此方式計算。本文所用的標(biāo)準重組DNA和分子克隆技術(shù)是本 領(lǐng)域熟知的并在如下文獻中有更全面的描述：Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，E.F.andManiatis， T.MolecularCloning：ALaboratoryManual;CoIdSpringHarborLaboratoryPress： ColdSpringHarbor，1989 (Sambrook，J.、Fritsch，E.F?和ManiatisT.，《分子克隆實驗 指南》，冷泉港實驗室出版社：冷泉港，1989年）（下文稱為"Sambrook"）。
[0126] 本文提供了可用于增強植物對昆蟲害蟲的抗性的隔離的多核苷酸、cDNA、多肽和 重組DNA構(gòu)建體。還提供了包含這些重組DNA構(gòu)建體的組合物（諸如植物或種子）以及利 用這些重組DNA構(gòu)建體的方法。
[0127] CRW2
[0128] crw2_Mutag(對玉米根蟲易感）和crw2_EMS是葉片被西部玉米根蟲（WCR)瘋狂 啃食的玉蜀黍突變體。由Crw2編碼的多肽為糖基轉(zhuǎn)移酶。糖基轉(zhuǎn)移酶是植物中的可將單 種或多種活化糖轉(zhuǎn)移到許多不同的小分子受體的一個大的超家族的成員。最近的研究已表 明，植物中的糖基轉(zhuǎn)移酶可能在植物生長、發(fā)育和對環(huán)境作出響應(yīng)的許多過程中發(fā)揮作用 (Wang，J.andHou，B. (2009)Front.Biol.China4:39-46 (Wang，J?和Hou，B.，2009 年，《中 國生物學(xué)前沿》，第4卷第39-46頁））。
[0129] ZmCrw2的突變等位基因（SEQIDN0 :1)以隱性方式遺傳，該遺傳受單個基因控 制。ZmCRW2(SEQIDN0:2)是得自玉米的糖基轉(zhuǎn)移酶。CRW2可以指ZmCRW2(SEQIDN0:2) 或其任一種同源物（SEQID吣：7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、20、22和23)。
[0130] CRffl
[0131] crwl (對玉米根蟲易感）是葉片被西部玉米根蟲（WCR)瘋狂啃食的玉蜀黍突變體 (Dhillon B,Moose SP ；and Johal GS. (2007). crwl~A novel maize mutant exceptionally susceptible to Western Corn Rootworm. Maize Genetics Conference. March 22-25， St. Charles,Illinois. Abstract and Presentation available online(Dhillon B、Moose SP和Johal GS在2007年3月22日至25日于美國伊利諾伊州圣查爾斯舉辦的玉米遺傳學(xué) 大會上的演講："crwl-對西部玉米根蟲格外易感的新型玉蜀黍突變體"，摘要和演講稿可 從網(wǎng)上獲得）），這種突變體并不常見，因為西部玉米根蟲通常以玉蜀黍的花粉和穗絲而不 是葉片為食。因此，通常使玉蜀黍葉片不受西部玉米根蟲歡迎的機理在這種突變體中似乎 失去了意義。
[0132] ZmCrwl以隱性方式遺傳并受單個基因控制。CRW1(SEQIDN0 :26)是得自玉米的 NAC轉(zhuǎn)錄因子。CRW1 可以指ZmCrwl(SEQIDN0:26)或其任一種同源物（SEQIDN0:27-44)。
[0133] 隔離的多核苷酸、cDNA和多肽
[0134] 本發(fā)明包括下列隔離的多核苷酸、cDNA和多肽：
[0135] -種隔離的多核苷酸或cDNA，其包含：（i)編碼具有這樣的氨基酸序列的多肽的 核酸序列，該氨基酸序列與SEQIDN0 :2、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、20、22 和 23以及它們的組合相比（基于ClustalW比對方法）具有至少50%、51%、52%、53%、 54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61 %、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、 69%、70%、71 %、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81 %、82%、83%、 84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91 %、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、 99%或100%的序列同一性；或（ii)⑴的核酸序列的完全互補序列，其中該完全互補序列 和（i)的