轉(zhuǎn)基因植物的轉(zhuǎn)基因種子。通過該方法得到的轉(zhuǎn)基因植 物可用于本發(fā)明的其他方法。
[0211] 用于從細胞或細胞培養(yǎng)基中分離出本發(fā)明的多肽的方法，其中該細胞包含重組 DNA構(gòu)建體，該重組DNA構(gòu)建體包含有效連接到至少一個調(diào)控序列的本發(fā)明的多核苷酸，并 且其中使轉(zhuǎn)化的宿主細胞在適于表達該重組DNA構(gòu)建體的條件下生長。
[0212] 改變本發(fā)明的多肽在宿主細胞中的表達水平的方法，包括：(a)用本發(fā)明的重組 DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化宿主細胞；以及（b)使轉(zhuǎn)化的宿主細胞在適于表達該重組DNA構(gòu)建體的條 件下生長，其中該重組DNA構(gòu)建體的表達導(dǎo)致本發(fā)明的多肽在轉(zhuǎn)化的宿主細胞中的水平發(fā) 生改變。
[0213] 增強植物對昆蟲害蟲植食性的抗性的方法，包括：(a)向可再生植物細胞中引入 重組DNA構(gòu)建體，該重組DNA構(gòu)建體包含有效連接到至少一個調(diào)控序列（例如，在植物中 有功能的啟動子）的多核苷酸，其中該多核苷酸編碼具有這樣的氨基酸序列的多肽，該氨 基酸序列與3￡〇10吣：2、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、20、22和23相比（基于 ClustalV比對方法）具有至少 50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、 60%、61 %、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71 %、72%、73%、74%、 75%、76%、77%、78%、79%、80%、81 %、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性；以及〇3) 在步驟（a)后從可再生植物細胞再生出轉(zhuǎn)基因植物，其中該轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含 所述重組DNA構(gòu)建體并表現(xiàn)出與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對照植物相比增強的對植物 害蟲的抗性。該方法還可以包括（c)獲得源自所述轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中所述子代 植物在其基因組中包含所述重組DNA構(gòu)建體并表現(xiàn)出與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對照 植物相比增強的對昆蟲害蟲植食性的抗性。所述至少一個調(diào)控元件可以是啟動子。例如， 啟動子可以是根特異性啟動子或玉蜀黍泛素啟動子。昆蟲害蟲可以是鞘翅目昆蟲害蟲。昆 蟲害蟲可以是葉甲屬或弧麗金龜屬的鞘翅目害蟲。昆蟲害蟲可以是鱗翅目昆蟲害蟲。鱗 翅目昆蟲害蟲可以是歐洲玉米螟。
[0214] 增強植物對昆蟲害蟲植食性的抗性的方法，包括：(A)向可再生植物細胞中引入： (i)第一重組DNA構(gòu)建體，其包含有效連接到至少一個調(diào)控元件的多核苷酸，其中所述多核 苷酸選自：（a)編碼具有SEQID從)：2、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、20、22和23所 示的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；(b)編碼具有這樣的氨基酸序列的多肽的多核苷酸， 該氨基酸序列與SEQIDN0 :2、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、20、22 和 23 相比（基 于(：111^&11比對方法）具有至少80%的序列同一性；和（(3)具有與（1)或（^)的多核苷 酸的核苷酸序列完全互補的核苷酸序列的多核苷酸；以及（ii)第二重組DNA構(gòu)建體，其包 含有效連接到至少一個調(diào)控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸選自：(a)編碼具有SEQID NO:26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43和44所示的氨基酸序列 的多肽的多核苷酸；(b)編碼具有這樣的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，該氨基酸序列與 5￡01〇吣：26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43和44相比（基 于ClustalW比對方法）具有至少80%的序列同一性；和（c)具有與（i)或（ii)的多核 苷酸的核苷酸序列完全互補的核苷酸序列的多核苷酸；以及（B)在步驟（A)后從可再生植 物細胞再生出轉(zhuǎn)基因植物，其中該轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含所述重組DNA構(gòu)建體并表 現(xiàn)出與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對照植物相比增強的對植物害蟲的抗性。該方法還可 以包括（C)獲得源自所述轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因組中包含所 述重組DNA構(gòu)建體并表現(xiàn)出與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對照植物相比增強的對昆蟲害 蟲植食性的抗性。所述至少一個調(diào)控元件可以是啟動子。例如，啟動子可以是本文所公開 的任一種啟動子，例如根特異性啟動子或玉蜀黍泛素啟動子。本文還提供了包含這種植物 細胞的植物。這種植物可展示出對昆蟲害蟲植食性的增強抗性。昆蟲害蟲可以是鞘翅目昆 蟲害蟲。鞘翅目昆蟲害蟲可以是葉甲屬或弧麗金龜屬的害蟲。昆蟲害蟲可以是鱗翅目昆蟲 害蟲。鱗翅目昆蟲害蟲可以是歐洲玉米螟。植物可以是單子葉植物。植物可以是玉蜀黍。
[0215] 增強植物對昆蟲害蟲植食性的抗性的方法，該方法包括：(a)向可再生植物細胞 中引入重組DNA構(gòu)建體，所述重組DNA構(gòu)建體包含有效連接到至少一個調(diào)控元件的多核苷 酸，其中所述多核苷酸包含核苷酸序列，其中所述核苷酸序列：(a)可在嚴格條件下與包含 SEQIDNO:1、19或21的完全互補序列的DNA分子雜交；或（b)通過由選自缺失、置換、添加 和插入的至少一種方法使一個或多個核苷酸改變而由SEQIDNO:1、19或21得到；以及（b) 在步驟（a)后從可再生植物細胞再生出轉(zhuǎn)基因植物，其中該轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含 所述重組DNA構(gòu)建體并表現(xiàn)出與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對照植物相比增強的對昆蟲 害蟲植食性的抗性。該方法還可以包括（c)獲得源自所述轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中所 述子代植物在其基因組中包含所述重組DNA構(gòu)建體并表現(xiàn)出與不包含所述重組DNA構(gòu)建體 的對照植物相比增強的對昆蟲害蟲植食性的抗性。
[0216] 評價植物對昆蟲害蟲的抗性的方法，包括：(a)獲得轉(zhuǎn)基因植物，其中該轉(zhuǎn)基因植 物在其基因組中包含重組DNA構(gòu)建體，該重組DNA構(gòu)建體包含有效連接到至少一個調(diào)控序 列（例如，在植物中有功能的啟動子）的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼具有這樣的氨基 酸序列的多肽，該氨基酸序列與SEQIDN0 :2、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、20、22 和 23 相比（基于ClustalV比對方法）具有至少 50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、 57%、58%、59%、60%、61 %、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71 %、 72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81 %、82%、83%、84%、85%、86%、 87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的序列 同一性；(b)獲得源自所述轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中該子代植物在其基因組中包含所 述重組DNA構(gòu)建體；以及（c)評價所述子代植物與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對照植物 相比的對昆蟲害蟲的抗性。
[0217] 在另一個實施例中，提供了評價植物對昆蟲害蟲的抗性的方法，包括：(a)獲得轉(zhuǎn) 基因植物，其中該轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含重組DNA構(gòu)建體，該重組DNA構(gòu)建體包含有 效連接到至少一個調(diào)控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼具有這樣的氨基酸序列的 多肽，該氨基酸序列與SEQIDN0 :2、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、20、22 和 23 相 比（基于ClustalV比對方法）具有至少 50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、 58%、59%、60%、61 %、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71 %、72%、 73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、 88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一 性；(b)使（a)部分的轉(zhuǎn)基因植物在讓多核苷酸表達的條件下生長；以及（c)評價（b)部分 的轉(zhuǎn)基因植物與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對照植物相比的對昆蟲害蟲的抗性。
[0218] 評價植物對昆蟲害蟲的抗性的方法，該方法包括：(a)獲得轉(zhuǎn)基因植物，其中該轉(zhuǎn) 基因植物在其基因組中包含重組DNA構(gòu)建體，該重組DNA構(gòu)建體包含有效連接到至少一個 調(diào)控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含核苷酸序列，其中該核苷酸序列：(a)可在嚴 格條件下與包含SEQIDN0 :1、19或21的完全互補序列的DNA分子雜交；或（b)通過由選 自缺失、置換、添加和插入的至少一種方法使一個或多個核苷酸改變而由SEQIDN0 :1、19 或21得到；(b)獲得源自所述轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中該子代植物在其基因組中包含 所述重組DNA構(gòu)建體；以及（c)評價所述子代植物與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對照植 物相比是否具有對昆蟲害蟲植食性的增強抗性。
[0219] 在本發(fā)明的任何前述方法或任何其他方法實施例中，在所述引入步驟中，所述可 再生植物細胞可包括愈傷組織細胞、胚性愈傷組織細胞、配子細胞、分生組織細胞、或幼胚 細胞。可再生植物細胞可源于近交玉蜀黍植物。
[0220] 在本發(fā)明的任何前述方法或任何其他方法實施例中，所述再生步驟可包括以下方 面：（i)在包含促進胚發(fā)生的激素的培養(yǎng)基中培育所述轉(zhuǎn)化的植物細胞，直至觀察到愈傷 組織；（ii)將步驟（i)的所述轉(zhuǎn)化的植物細胞轉(zhuǎn)移至包含促進組織機體形成的激素的第一 培養(yǎng)基中；以及（iii)在第二培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)步驟（ii)后的所述轉(zhuǎn)化的植物細胞，以允 許嫩芽伸長、根發(fā)育或這兩者同時發(fā)生。
[0221 ] 在本發(fā)明的任何前述方法或任何其他方法實施例中，至少一個調(diào)控元件可以是啟 動子。例如，啟動子可以是根特異性啟動子或玉蜀黍泛素啟動子。昆蟲害蟲可以是鞘翅目 昆蟲害蟲。昆蟲害蟲可以是葉甲屬或弧麗金龜屬的鞘翅目害蟲。昆蟲害蟲可以是鱗翅目昆 蟲害蟲。鱗翅目昆蟲害蟲可以是歐洲玉米螟。表型分析可采用選擇性攝食試驗建立。
[0222] 將本發(fā)明的重組DNA構(gòu)建體引入植物可通過任何合適的技術(shù)進行，這些技術(shù) 包括但不限于引導(dǎo)DNA攝取、化學(xué)處理、電穿孔、顯微注射、細胞融合、感染、載體介導(dǎo)的 DNA轉(zhuǎn)移、轟擊或農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。用于植物轉(zhuǎn)化和再生的技術(shù)已在國際專利公布W0 2009/006276中進行了描述，該專利公布的內(nèi)容以引用方式并入本文。含有編碼所關(guān)注蛋白 質(zhì)的外來的外源性分離核酸片段的植物的發(fā)育或再生是本領(lǐng)域所熟知的?？墒乖偕闹参?自花授粉以產(chǎn)生純合的轉(zhuǎn)基因植物。另外，將從再生的植物獲得的花粉與農(nóng)學(xué)上重要的品 系的種子培育植株進行雜交。反過來，用來自這些重要品系的植物的花粉對再生的植物授 粉。利用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的方法培育含有所需多肽的本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物。
[0223] 在另一個實施例中，提供了鑒定賦予植物對昆蟲害蟲植食性的增強抗性的Crw2 變體的方法。這種方法包括：(a)通過基因改組將一個或多個核苷酸序列合并，所述一個或 多個核苷酸序列編碼SEQIDN0 :2、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、20、22和23的一 個或多個片段，或與SEQIDNO:2、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、20、22 和 23 具有 至少70%同一性的蛋白質(zhì)或其片段；(b)將來自步驟（a)的改組序列轉(zhuǎn)化進可再生植物細 胞的群體中；(c)從步驟（b)的轉(zhuǎn)化的可再生植物細胞的群體再生出轉(zhuǎn)化植物的群體；(d) 從來自步驟（c)的轉(zhuǎn)化植物的群體篩選對所述昆蟲害蟲增強的抗性；以及（e)從轉(zhuǎn)化的植 物中鑒定出表現(xiàn)增強的抗性的變體。該方法還可以包括：（f)向可再生植物細胞引入包含 賦予植物對昆蟲害蟲植食性的增強抗性的Crw2變體的重組構(gòu)建體；（g)在步驟（f)后從所 述可再生植物細胞再生出轉(zhuǎn)基因植物，其中該轉(zhuǎn)基因植物在其基因組中包含所述重組DNA 構(gòu)建體；以及（h)選擇（g)的轉(zhuǎn)基因植物，其中該轉(zhuǎn)基因植物包含所述重組DNA構(gòu)建體并表 現(xiàn)出與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對照植物相比增強的對所述昆蟲害蟲的抗性。
[0224] 術(shù)語"基因改組"和"定向進化"在本文中可互換使用。"基因改組"方法包括反復(fù) 進行DNA改組，繼之以適當(dāng)篩選和/或選擇，以產(chǎn)生具有改良生物活性的Crw2核酸或其部 分的變體（Castleetal.，（2004)Science304(5674) :1151-4(Castle等人，2004 年，《科 學(xué)》，第 304 卷第 5674 期，第 1151-1154 頁）；美國專利No. 5, 811，238 和No. 6, 395, 547)。
[0225] 本發(fā)明還提供了通過傳統(tǒng)連鎖繪圖鑒定出玉蜀黍中與對昆蟲害蟲植食性的增強 抗性相關(guān)聯(lián)的Crw2等位基因變體的方法。在一些實施例中，通過以下方式鑒定出所述等位 基因變體：(a)將對所述昆蟲害蟲具有不同抗性水平的兩種玉蜀黍植物雜交；(b)關(guān)于編碼 包含SEQIDN0 :2、20或22的蛋白質(zhì)的多核苷酸序列、或在調(diào)控編碼所述蛋白質(zhì)的多核苷 酸的表達的基因組區(qū)中評價子代植物中的等位基因變異；(C)對子代植物對所述昆蟲害蟲 的抗性進行表型分析；（d)將等位基因變異與所述抗性相關(guān)聯(lián)；以及（e)鑒定出與對所述昆 蟲害蟲的抗性增強相關(guān)聯(lián)的等位基因。本文提供了一種鑒定出玉蜀黍植物中與對昆蟲害蟲 植食性的增強抗性相關(guān)聯(lián)的Crw2等位基因變體的方法，其中該方法包括以下步驟：a)將對 所述昆蟲害蟲具有不同抗性水平的兩種玉蜀黍植物雜交；b)關(guān)于編碼包含SEQIDNO:2的 蛋白質(zhì)的多核苷酸序列、或在調(diào)控編碼所述蛋白質(zhì)的多核苷酸的表達的基因組區(qū)中評價子 代植物中的等位基因變異；c)對子代植物對所述昆蟲害蟲的抗性進行表型分析；d)將等位 基因變異與所述抗性相關(guān)聯(lián)；以及e)鑒定出與對所述昆蟲害蟲的抗性增強相關(guān)聯(lián)的等位 基因。表型分析步驟（c)可使用本領(lǐng)域已知的評估抗昆蟲害蟲性的任何方法執(zhí)行，例如，由 歷史數(shù)據(jù)獲得群體中每種植物的抗性，或可使用本文所示的選擇性攝食試驗執(zhí)行。
[0226] 在其他實施例中，通過全基因組關(guān)聯(lián)分析鑒定等位基因變體，方式為：(a)獲得玉 蜀黍植物的群體，其中所述玉蜀黍植物表現(xiàn)出對所述昆蟲害蟲的不同抗性水平；(b)關(guān)于 編碼包含SEQIDN0 :2的蛋白質(zhì)的多核苷酸序列、或在調(diào)控編碼所述蛋白質(zhì)的多核苷酸的 表達的基因組區(qū)中評價等位基因變異；（c)將等位基因變異與所述抗性相關(guān)聯(lián)；以及（d)鑒 定出與對所述昆蟲害蟲的抗性增強相關(guān)聯(lián)的等位基因變體?？剐钥梢允褂帽绢I(lǐng)域的普通技 術(shù)人員已知的任何方法或選擇性攝食試驗來評估?；蛘?，也可以使用有關(guān)抗性的歷史表型 數(shù)據(jù)。
[0227] 本發(fā)明還提供了鑒定表現(xiàn)出對昆蟲害蟲植食性的抗性增強的玉蜀黍植物的方法， 該方法包括：(a)檢測玉蜀黍植物的基因組中是否存在與對所述昆蟲害蟲的抗性增強相關(guān) 聯(lián)的至少一個Crw2等位基因變體（其中所述等位基因變體可使用上述方法鑒定）；以及 (b)鑒定含有所述至少一個等位基因變體的玉蜀黍植物。該方法還可以包括：（c)將所述玉 蜀黍植物與第二種玉蜀黍植物雜交；以及（d)鑒定并選擇得自所述雜交的具有所述等位基 因變體的子代植物。
[0228] 在任何上述方法中，昆蟲害蟲可以是鞘翅目昆蟲，該鞘翅目昆蟲可以是葉甲屬或 弧麗金龜屬的昆蟲。
[0229] 或者，昆蟲害蟲可以是鱗翅目昆蟲，該鱗翅目昆蟲可以是桿野螟屬、白蛾屬或刀夜 蛾屬昆蟲。
[0230] 昆蟲害蟲可以是玉米根蟲的任何種、日本金龜子、歐洲玉米螟、美國白蛾或 cattailcaterpillar(Simyrainsularis)〇
[0231] 在任何上述方法中，對抗昆蟲害蟲性的評價可包括本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的任 何方案。也可以使用本文所示的選擇性攝食試驗。
[0232] 在任何上述方法中，植物為單子葉植物，并且可以是玉蜀黍。
[0233] 實您1
[0234] 以下實例進一步闡述本發(fā)明，其中除非另有規(guī)定，否則份數(shù)和百分比均按重量計， 而度是指攝氏度。應(yīng)當(dāng)理解，這些實例雖然指出本發(fā)明的實施例，但僅以舉例說明的方式給 出。根據(jù)以上討論和這些實例，本領(lǐng)域技術(shù)人員可確定本發(fā)明的必要特征，并且在不脫離本 發(fā)明的實質(zhì)和范圍的情況下，可對本發(fā)明作出各種變化和修改以使其適合于各種應(yīng)用和條 件。因此，根據(jù)前文的描述，除了本文中顯示和描述的修改外的本發(fā)明的各種修改對于本領(lǐng) 域技術(shù)人員來說將顯而易見。這類修改形式也旨在落入所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
[0235]實例 1
[0236] 葉片詵擇件攝畬試驗
[0237] 執(zhí)行了選擇性攝食試驗以評估Crw2突變型植物和野生型植物對玉米根蟲的抗性 水平。使用包括可拆卸封蓋的PVC盒，將等重量的從突變型植物和