野生型植物兩者新鮮采 摘的成熟葉片以隨機方式貼附到潤濕的濾紙上。將已被禁食過夜的西部玉米根蟲和南部玉 米根蟲放入盒中。先前的觀察表明，昆蟲通常首先會隨機試探啃咬，之后才會確定其攝食偏 好，且該攝食偏好的確定通常發(fā)生在前45分鐘內(nèi)；優(yōu)先的攝食通常持續(xù)到昆蟲選擇的葉片 被完全吞食為止。用0至5的標(biāo)度對葉片攝食情況打分，0表示完好無損，5表示被完全毀 損。
[0238] 實例 2
[0239] Crw2基因的克降和騎證
[0240] 從HMS群體中分離出對西部玉米根蟲成蟲表現(xiàn)出增強的易感性的玉蜀黍突變體， 命名為crw2-EMS。獨立地，從源于Mu活性品系的F2群體中鑒定出另一種具有西部玉米根 蟲易感性的突變體，命名為crw2-Mutag。Crw2突變體顯示出對西部玉米根蟲成蟲以及日本 金龜子和歐洲玉米螟（在用田間試驗評估時，稱為ECB)增強的易感性。將crw2-EMS和 Crw2-Mutag兩者以單基因隱性方式分離并繪制到5號染色體的同一區(qū)域中，它們在正反交 中為彼此的等位基因。采用共分離分析從CrW2-Mutag突變體中分離出候選基因；據(jù)發(fā)現(xiàn)該 基因（SEQIDN0:1)能夠編碼推定的同聚半乳糖醛酸（HGA1)，HGA1也被標(biāo)注為"糖基轉(zhuǎn)移 酶AER61"或"推定的非典型蛋白"。該候選基因包含兩個外顯子和一個內(nèi)含子，編碼445個 氨基酸（aa)長且具有一個20aa的跨膜螺旋（TMH)(從肽的第13位氨基酸到第32位氨基 酸）的產(chǎn)物（SEQIDN0 :2)。預(yù)期該跨膜螺旋可將所述蛋白定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)/高爾基體中， 此時該肽的前12個氨基酸面向細胞器內(nèi)部，其余氨基酸（從第33位氨基酸到第455位氨 基酸）進入細胞質(zhì)中懸在細胞器外。Crw2-Mutag的克隆和序列（SEQIDN0:3是cDNA的 核苷酸序列，SEQIDNO:4是所編碼多肽的氨基酸序列）揭示Mu-元件添加了 145bp長度 (參見圖1A-圖1G的比對）。
[0241] 為了驗證該候選基因，使用一組巢式引物從crw2-EMS突變等位基因（SEQIDN0 :5 是cDNA的核苷酸序列而SEQIDN0 :6是編碼多肽的氨基酸序列）及其祖基因MQ20W(-種 公共玉蜀黍近交系）擴增出全長基因。同M020WHGA1基因相比，在crw2-EMS等位基因中 檢測到了單個氨基酸改變R292C(圖2A-圖2F)。該氨基酸改變位于HGA1的保守區(qū)，可能是 crw2-EMS突變的肇因等位基因。分離出具有位于EMS等位基因與Mu標(biāo)簽等位基因的位置 之間的增變基因插入的獨立TUSC等位基因，使其接受表型分析和分子分析。據(jù)發(fā)現(xiàn)TUSC 等位基因為crw2-Mutag等位基因的等位基因，其對西部玉米根蟲成蟲和日本金龜子顯示 出類似的增強易感性。圖3示出玉蜀黍的Crw2基因結(jié)構(gòu)和每種Crw2突變的位置的示意 圖。在對西部玉米根蟲高度易感的雙單倍體株系中對該基因的功能進行了額外的驗證。利 用RT-PCR分析在雙單倍體株系中檢查了ZmCrwl和Crw2ZmCrw2的表達。結(jié)果表明ZmCrwl 在該雙單倍體株系中表達，而ZmCrw2不表達（圖9)。
[0242] 實例 3
[0243] 鑒宙玉蜀黍CM2多肽的同源物
[0244] 可使用美國國家生物技術(shù)信息中心（NCBI)提供的BLASTP算法分析玉蜀黍CRW2 多肽與"nr"數(shù)據(jù)庫中包含的全部可公開獲得的氨基酸序列的相似性，并分析玉蜀黍CRW2 多肽與DUPONT?專有內(nèi)部數(shù)據(jù)庫的相似性。
[0245] 使用玉蜀黍CRW2多肽的序列（SEQIDN0 :2)進行的BLAST搜索揭示玉蜀黍CRW2 多肽與得自各種生物體的同聚半乳糖醛酸的相似性。表1(非專利文獻）示出的是玉蜀黍 CRW2的氨基酸序列的BLASTP結(jié)果。圖1還示出了使用ClustalW比對方法、用默認參數(shù)得 至_每對氨基酸序列的序列同一性百分比值：
[0246] 表1 :玉蜀黍CRW2多肽的BLASTP結(jié)果（非專利文獻）
[0247]
[0248] *指示該序列在內(nèi)部專有數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)
[0249] 圖 4A-圖 4J展示SEQIDN0 :2、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、20、22和23 所示的多肽氨基酸序列的比對。圖5展示圖4A-圖4J所示的每個序列對的序列同一性百 分比和趨異度值。
[0250] 序列比對和同一性百分數(shù)計算使用LASERGENE".生物信息學(xué)計算軟件包 (美國威斯康星州麥迪遜市DNASTAR有限公司（DNASTARI;Inc.，Madison，W1))的 MegaligrT程序進行。序列的多重比對使用ClustalW比對方法（Thompsonetal. (1994) NucleicAcidsResearch. 22 :4673_80(Thompson等人，1994 年，《核酸研究》，第 22 卷，第 4673-4680頁））、用默認參數(shù)（空位罰分=10,空位長度罰分=0. 20)進行。使用Clustal 方法進行雙序列比對的默認參數(shù)是：空位罰分=10. 00,空位長度=0. 10。所用的蛋白權(quán)重 矩陣為Gdiinet系列。
[0251]實例 4
[0252] 突奪體和野牛銦沂親中211￡^2基_的RT-PCR分析
[0253] 從c/w2-Mutag突變體及其野生型近親的10天大幼苗的葉、莖和根組織采集了總 RNA樣品，使用基因特異性引物（SEQIDN0 :24和SEQIDN0 :25 ;圖6A)完成了RT-PCR分 析。crw2-Mutag突變體在三種組織中顯示差異表達（在莖樣品中比在葉和根樣品中更多）， 其轉(zhuǎn)錄物比野生型近親中的轉(zhuǎn)錄物長145bp。crw2-Mutag轉(zhuǎn)錄物的克隆和測序揭示Mu-元 件干擾了內(nèi)含子剪接。Mu-元件添加了 141bp的MuTIR(末端反向重復(fù)）和4bp到9bp的同 向重復(fù)，導(dǎo)致讀框移位（與野生型相比最后73個氨基酸發(fā)生改變）。對crw2-TUSC突變體 的RT-PCR分析顯示與其野生型近親相比，葉中完全不存在Crw2轉(zhuǎn)錄物（圖6B)。
[0254]實例 5
[0255] 伸用Lvnx數(shù)據(jù)庫研究2111(>￥2基_在不同組織中的表汰
[0256] Lynx數(shù)據(jù)庫顯示ZmCrw2在例如伸長的節(jié)間、根、抽絲期的內(nèi)荀P十、穗和維管束的 不同組織中的表達相對較低，分別為：伸長的節(jié)間（370PPM)，根（367PPM)，抽絲期的內(nèi)苞葉 (324PPM)，穗（310PPM)，維管束（220PPM)(圖7)。ZmCrw2基因在葉組織（具體地講，V5期 的葉組織）中的表達是最高的（300PPM);然而，在V5期葉組織中的表達作為對歐洲玉米螟 (ECB)感染的響應(yīng)而顯著下降。當(dāng)V5期葉輪感染ECB幼蟲時，感染后0h、3h、6h和24h的 ZmC/w2 表達分別為 300RPM、200RPM、150RPM和 137RPM。
[0257]實例 6
[0258] Crwl和Crw2通路分析
[0259] crw2_EMS的TB0染色產(chǎn)生了與crwl-Ac相同的圖案，表明這兩種突變體在單個遺 傳通路或網(wǎng)絡(luò)中均存在缺陷。
[0260] 為了進一步研究該聯(lián)系，將Crwl突變體與野生型植物的Crw2轉(zhuǎn)錄物水平在昆蟲 攝食后各時間點的差異進行了比較。將crwl-Ac突變體及其野生型近親的七周大植株封閉 在田間的棚中，然后用已禁食了 16小時的成年甲蟲感染。在感染后0分鐘、45分鐘、1小時、 6小時、12小時、24小時、36小時和48小時采集RNA。然后將突變體和野生型近親在不同時 間點的RNA樣品合并，突變體為池1，野生型近親為池2。評價了兩個池中的每一個在各時 間點的Crw2轉(zhuǎn)錄物水平。很快（45分鐘）觀察到野生型近親較之crwl-Ac突變植物出現(xiàn) 了Crw2轉(zhuǎn)錄物水平的大幅上調(diào)（圖8)。這些結(jié)果還在RNA測序?qū)嶒炛械玫搅俗C實，其中 Crw2轉(zhuǎn)錄物水平是Crwl野生型近親中該水平的2. 8倍（在log2尺度上）。這些結(jié)果指示 Crw2為昆蟲誘導(dǎo)型突變體，其對昆蟲攝食作出響應(yīng)的能力取決于具有功能性Crwl產(chǎn)物。
[0261] 這些結(jié)果還表明Crwl和Crw2屬于同一個遺傳或生化網(wǎng)絡(luò)，并且Crw2可以在Crwl 的下游起作用。
[0262]實例 7
[0263] Crw2在棺物中的討表汰
[0264] 可使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的方法將玉蜀黍Crw2基因或其任一種同源物插 入載體中，然后可進一步將該載體轉(zhuǎn)化進植物（包括但不限于玉蜀黍）?？刹捎门c前述實例 中相似的方式或使用任何已知的評估方法執(zhí)行表型分析，以確定植物對昆蟲害蟲（例如但 不限于西部玉米根蟲、日本金龜子和歐洲玉米螟）的抗性。
[0265] 玉蜀黍轉(zhuǎn)化載體通過構(gòu)造Gateway感受態(tài)入門載體而構(gòu)建，在該感受態(tài)入門載體 中，將含有ZM-CRW2的DNA片段連接到含有玉蜀黍泛素啟動子的載體，得到了其中ZM-Crw2 的表達受到玉蜀黍泛素啟動子驅(qū)動的表達盒。經(jīng)由LR反應(yīng)（按照英杰公司（Invitrogen) 就GatewayLR反應(yīng)描述的方法進行）將所得的入門載體與另一載體組合，產(chǎn)生適于對玉蜀 黍進行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化的構(gòu)建體。
[0266] 使用骨架中具有SB-RCC3啟動子的載體作為接受入門載體，以相似的方式構(gòu)建了 第二載體，得到了其中ZM-Crw2的表達受到SB-RCC3啟動子（一種得自高粱的根特異性啟 動子（US20120210463))驅(qū)動的表達盒。經(jīng)由LR反應(yīng)將所得的入門載體與另一載體組合， 產(chǎn)生適于進行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化的構(gòu)建體。
[0267] 產(chǎn)生了 T0玉蜀黍植物，將該植物置于溫室中以供表型分析。
[0268] 實例 8
[0269] Crwl和Crw2在植物中的過表達
[0270] 可利用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的方法使Crwl和Crw2在植物中過表達。Crwl 基因可得自玉蜀黍（例如SEQIDN0:26)，或可以是ZmCrwl基因的同源物（SEQIDNO: 27-44)。相似地，Crw2基因可得自玉蜀黍（SEQIDN0:i)，或可以是ZmCrw2基因的同源物。 可如之前的實例中所述或使用本領(lǐng)域已知的任何方法執(zhí)行表型分析，以確定植物對昆蟲害 蟲（例如但不限于西部玉米根蟲、日本金龜子和歐洲玉米螟）的抗性。
[0271]實例 9
[0272] Crw2突奪表銦的講一步評估
[0273] 在2012年和2013年的夏季，從五月初到六月末，將Crw2突變體和相應(yīng)的野生型 (WT)近親以每兩周一次的時間間隔種植在田間。在西部玉米根蟲壓力處于其最大值的七月 中旬評估了西部玉米根蟲造成的植物蟲害。不考慮突變幼苗的可用性，在Crw2突變植物達 到5周齡或更大之前均未觀察到葉的易感性表型。從那時起，葉片損壞繼續(xù)穩(wěn)步惡化，最終 導(dǎo)致突變植物在重度西部玉米根蟲感染下完全脫葉。此外，Crw2突變體深受各種不同的植 食性昆蟲之害，包括日本金龜子、歐洲玉米螟、美國白蛾和cattailcaterpillar。
[0274] 實例 10
[0275] 玉蜀黍〇￥2基_的牛物化學(xué)特件
[0276] 用甲苯胺藍0(TB0)(其與細胞壁中的游離羥基基團反應(yīng)）將Crw2突變體葉片染 色，結(jié)果顯示葉脈間細胞的染色減弱，這可能導(dǎo)致抗拉強度受損。為了測試這種染色減弱是 否是細胞壁結(jié)合的對香豆酸（PCA)和阿魏酸（FA)的水平降低所致，用Crw2葉片和野生型 葉片的幼年（V3期）上皮細胞壁和成年（V8期）上皮細胞壁進行了對這些羥基肉桂酸的定 量。在Crw2突變體中觀察到pCA水平和FA水平較之野生型近親顯著降低，但這種顯著降 低只在成葉中觀察到（圖10A)。
[0277] 為了確定這種羥基肉桂酸水平降低是否還導(dǎo)致了木質(zhì)素水平降低，從成年（V8 期）Crw2突變體葉片和野生型近親葉片的分離細胞壁作為乙酰溴可溶性（ABS)部分提取出 木質(zhì)素，隨后通過紫外光譜法進行了分析。果不其然，Crw2突變體的成葉中的ABS木質(zhì)素水 平較之野生型葉片中的ABS木質(zhì)素水平明顯低得多（p< 0. 05 ;非配對t檢驗）（圖10B)。
【主權(quán)項】
1. 一種增強植物對昆蟲害植食性的抗性的方法，包括： (a) 向可再生植物細胞中引入重組DNA構(gòu)建體，所述重組DNA構(gòu)建體包含有效連接到至 少一個調(diào)控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼具有這樣的氨基酸序列的多肽，所述 氨基酸序列基于 Clustal W 比對方法與 SEQ ID NO :2、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、 18、20、22和23相比具有至少80 %的序列同一性；以及 (b) 在步驟（a)后從所述可再生植物細胞再生出轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物在 其基因組中包含所述重組DNA構(gòu)建體并表現(xiàn)出與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對照植物相 比增強的對植物害蟲的抗性。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，還包括： (c) 獲得源自所述轉(zhuǎn)基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因組中包含所述 重組DNA構(gòu)建體并表現(xiàn)出與不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對照植物相比增強的對昆蟲害蟲 植食性的抗性。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述昆蟲害蟲為鞘翅目（Coleopteran)昆蟲。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述昆蟲害蟲為鱗翅目（L印idopteran)昆蟲。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述植物為單子葉植物。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述單子葉植物為玉蜀黍。7. -種鑒定賦予植物對昆蟲害蟲植食性的增強抗性的Crw2變體的方法，所述方法包 括以下步驟： a. 通過基因改組將一個或多個核苷酸序列合并，所述一個或多個核苷酸序列編碼SEQ ID NO :2的一個或多個片段，或與SEQ ID NO :2具有至少70%同一性的蛋白質(zhì)或其片段； b. 將來自步驟（a)的所述改組序列轉(zhuǎn)化進可再生植物細胞的群體； c. 從步驟（b)的轉(zhuǎn)化的可再生植物細胞的群體再生出轉(zhuǎn)化植物的群體； d. 從來自步驟（c)的轉(zhuǎn)化植物的群體篩選對所述昆蟲害蟲增強的抗性；以及 e. 從所述轉(zhuǎn)化植物中鑒定出表現(xiàn)所述增強的抗性的變體。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述方法還包括以下步驟： f. 向可再生植物細胞引入重組構(gòu)建體，所述重組構(gòu)建體包含通過權(quán)利要求7所述的方 法鑒定出的Crw2變體； g. 在步驟（f)后從所述可再生植物細胞再生出轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物在其 基因組中包含所述重組DNA構(gòu)建體；以及 h. 選擇（g)的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物包含所述重組DNA構(gòu)建體并表現(xiàn)出與 不包含所述重組DNA構(gòu)建體的對照植物相比增強的對所述昆蟲害蟲的抗性。9. 根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的方法，其中所述昆蟲害蟲為鞘翅目（Coleopteran)昆蟲。10. 根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的方法，其中所述昆蟲害蟲為鱗翅目（L印idopteran)昆 蟲。11. 根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的方法，其中所述植物為單子葉植物。12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述單子葉植物為玉蜀黍。13. -種鑒定玉蜀黍植物中的Crw2等位基因變體的方法，其中所述等位基因變體與對 昆蟲害蟲植食性的抗性增強相關(guān)，所述方法包括以下步驟： a.獲得玉蜀黍植物的群體，其中所述玉蜀黍植物表現(xiàn)出對所述昆蟲害蟲的不同抗性水 平； b. 關(guān)于編碼包含SEQ ID NO :2的蛋白質(zhì)的多核苷酸序列、或在調(diào)控編碼所述蛋白質(zhì)的 多核苷酸的表達的基因組區(qū)中評價等位基因變異； c. 將等位基因變異與所述抗性相關(guān)聯(lián)；以及 d. 鑒定出與對所述昆蟲害蟲的抗性增強相關(guān)聯(lián)的等位基因變體。14. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述昆蟲害蟲為鞘翅目（Coleopteran)昆蟲。15. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述昆蟲害蟲為鱗翅目（L印idopteran)昆蟲。
【專利摘要】本發(fā)明提供了用于增強植物對昆蟲害蟲諸如玉米根蟲的抗性的方法和組合物。本發(fā)明提供了用于在宿主植物或植物細胞中過表達Crw2或其變體以增強植物諸如玉蜀黍?qū)ハx害蟲的抗性的方法。本發(fā)明還提供了用于鑒定在經(jīng)由轉(zhuǎn)基因或傳統(tǒng)育種方法摻入植物時會增強植物諸如玉蜀黍?qū)ハx害蟲的抗性的Crw2變體的方法。本發(fā)明還提供了通過表達Crw1和Crw2來增強抗性的方法。
【IPC分類】C12N15/87, C12N15/82, C12N5/04, A01H5/00, C12N5/00
【公開號】CN105008540
【申請?zhí)枴緾N201380060330
【發(fā)明人】G.S.喬哈爾, 李柏林, D.S.穆爾塔尼
【申請人】納幕爾杜邦公司, 先鋒國際良種公司, 普渡研究基金會
【公開日】2015年10月28日
【申請日】2013年9月20日
【公告號】CA2886118A1, US20150240257, WO2014047508A1