通過(guò)引物延伸合成探針庫(kù)的制作方法
【專利說(shuō)明】通過(guò)引物延伸合成探針庫(kù)
[0001]
[0002]長(zhǎng)期以來(lái)，已將染色體重排、缺失和其它畸變與遺傳疾病相關(guān)。染色體結(jié)構(gòu)異常通常起因于同源重組中的錯(cuò)誤。結(jié)構(gòu)異?？沙霈F(xiàn)在配子中并因此將存在于受影響個(gè)體的所有細(xì)胞中，或者它們可在有絲分裂期間出現(xiàn)并產(chǎn)生具有一些正常細(xì)胞和一些異常細(xì)胞的遺傳嵌合個(gè)體。
[0003]持續(xù)需要開(kāi)發(fā)有效的方法以制造用于基因組學(xué)，特別是用于染色體異常的檢測(cè)和分析的探針。
[0004]概沭
[0005]本文提供通過(guò)引物延伸產(chǎn)生探針庫(kù)的方法。在某些實(shí)施方式中，所述方法包括:使包含具有下式VfB-3’的頂鏈(top strand)序列的第一寡核苷酸的群體與包含具有下式V2’ -B’ -3’的底鏈(bottom strand)序列的第二寡核苷酸的群體雜交以提供雙鏈體的群體。在這些實(shí)施方式中，B和B’的核苷酸序列互補(bǔ)且它們的長(zhǎng)度為至少15個(gè)核苷酸；第一群體的每種寡核苷酸的B的核苷酸序列相同；第二群體的每種寡核苷酸的B’的核苷酸序列相同A的核苷酸序列在第一群體的寡核苷酸之間是可變的；V2’的核苷酸序列在第二群體的寡核苷酸之間是可變的；且1和￥2’與參考基因組中的不同位點(diǎn)雜交。雜交之后，使雙鏈體中寡核苷酸的3’末端延伸以產(chǎn)生雙鏈產(chǎn)物的群體，所述雙鏈產(chǎn)物包含具有下SV1-B-V2的頂鏈序列，其中VgV 2’互補(bǔ)。
附圖簡(jiǎn)介
[0006]本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，下述附圖僅用于闡釋目的。附圖不旨在以任何方式限制本教導(dǎo)的范圍。
[0007]圖1示意性闡釋了本方法的一個(gè)實(shí)施方式的一些一般原理。
[0008]圖2示意性闡釋了本方法的一個(gè)實(shí)施方式的另一些原理。
[0009]圖3示意性闡釋了可如何應(yīng)用本方法來(lái)制造單鏈探針。
[0010]圖4示意性闡釋了通過(guò)本方法產(chǎn)生的單鏈產(chǎn)物的一些特征。
[0011]圖5示意性闡釋了暈環(huán)(halo)探針的兩種類型。
[0012]圖6示意性闡釋了可如何將本方法的產(chǎn)物用于基因組分析。
[0013]圖7顯示了可如何通過(guò)引物延伸來(lái)制造暈環(huán)探針。
[0014]圖8顯示了可如何擴(kuò)展圖7中所示的一般原理以制造多個(gè)暈環(huán)探針。
[0015]定義
[0016]在更詳細(xì)描述示例性實(shí)施方式之前，給出下列定義以闡釋和定義說(shuō)明書(shū)中所用術(shù)語(yǔ)的含義和范圍。
[0017]數(shù)值范圍包括限定該范圍的數(shù)值。除非另有說(shuō)明，分別地，核酸是以5’到3’方向從左往右書(shū)寫(xiě)，氨基酸序列是以氨基到羧基方向從左往右書(shū)寫(xiě)。
[0018]除非另外定義，本文所使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有本發(fā)明所屬的領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。Singleton,等人，DICT1NARY OF MICROB1LOGY ANDMOLECULAR B1LOGY,第2版，John Wiley and Sons, New York(1994),和Hale&Markham, THEHARPER COLLINS DICT1NARY OF B1LOGY, Harper Perennial, N.Y.(1991)向技術(shù)人員提供了許多本文所用術(shù)語(yǔ)的一般含義。盡管如此，為了清楚和容易參考，下文對(duì)某些術(shù)語(yǔ)進(jìn)行定義。
[0019]必須注意:當(dāng)在本文和所附權(quán)利要求中使用時(shí)，除非上下文明確指出相反情況，否則不使用數(shù)量詞時(shí)涵蓋復(fù)數(shù)的指代物。例如，術(shù)語(yǔ)“引物”指一個(gè)/種或多個(gè)/種引物，即單個(gè)/種引物和多個(gè)/種引物。還應(yīng)注意:權(quán)利要求可撰寫(xiě)成排除任何任選元素。因此，該陳述旨在作為使用與權(quán)利要求要素的引述相聯(lián)系的這些排他性術(shù)語(yǔ)如“僅僅”、“僅”等或使用“否定性”限制的在先基礎(chǔ)。
[0020]術(shù)語(yǔ)“核苷酸”旨在包括那些不僅含有已知嘌呤和嘧啶堿基還含有已被修飾的其它雜環(huán)堿基的部分(moiety)。這些修飾包括甲基化的嘌呤或嘧啶，酰基化的嘌呤或嘧啶，烷基化的核糖或其它雜環(huán)。此外，術(shù)語(yǔ)“核苷酸”包括那些包含半抗原或熒光標(biāo)記以及可以不僅包含常規(guī)核糖和脫氧核糖，也可以包含其它糖的部分。經(jīng)修飾的核苷或核苷酸也包括對(duì)糖部分的修飾，例如，其中一個(gè)或多個(gè)羥基被鹵素原子或脂肪族基團(tuán)取代，官能化為醚、胺等。
[0021]術(shù)語(yǔ)“核酸”和“多核苷酸”在本文中可以互換使用，其用于描述任意長(zhǎng)度的由核苷酸例如脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸構(gòu)成的聚合物，例如，多于約2個(gè)堿基，多于約10個(gè)堿基，多于約100個(gè)堿基，多于約500個(gè)堿基，多于1000個(gè)堿基，高達(dá)約10000個(gè)或更多堿基，并可酶促地或合成地生產(chǎn)(例如，如美國(guó)專利號(hào)5，948，902和其中所引用的參考文獻(xiàn)中所述的PNA)，其可以與天然存在的核酸以序列特異性的方式進(jìn)行雜交，該方式與兩種天然存在的核酸雜交類似，例如，能夠參與沃森-克里克堿基配對(duì)相互作用。天然存在的核苷酸包括鳥(niǎo)嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶(分別為G、C、A、T和U)。DNA和RNA分別具有脫氧核糖和核糖骨架，但PNA的骨架由通過(guò)肽鍵相連的重復(fù)N-(2-氨乙基)-甘氨酸單元構(gòu)成。在PNA中，多種嘌呤和嘧啶堿基通過(guò)亞甲基羰基鍵連接到骨架上。鎖核酸(LNA)(通常被稱為無(wú)法接近的RNA)是經(jīng)修飾的RNA核苷酸。LNA核苷酸的核糖部分被連接2’氧和4’碳的額外橋修飾。所述橋?qū)⒑颂恰胺怄i”為3’ -內(nèi)(北(North))構(gòu)象，這通常發(fā)現(xiàn)于A-型雙鏈體(duplex)中。只要期望，可將LNA核苷酸與寡核苷酸中的DNA或RNA殘基混合。術(shù)語(yǔ)“非結(jié)構(gòu)化核酸”或“UNA”是含有相互之間結(jié)合的穩(wěn)定性較低的非天然核苷酸的核酸。例如，非結(jié)構(gòu)化核酸可含有G’殘基和C’殘基，其中這些殘基對(duì)應(yīng)于G和C的非天然存在形式(即類似物)，它們穩(wěn)定性較低地相互堿基配對(duì)，但保留分別與天然存在的C和G殘基堿基配對(duì)的能力。US20050233340中描述了非結(jié)構(gòu)化核酸，其中關(guān)于UNA的公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用被并入本文。
[0022]本文所使用的術(shù)語(yǔ)“寡核苷酸”表示長(zhǎng)度為約2-200個(gè)核苷酸，直至500個(gè)核苷酸的單鏈核苷酸多聚體。寡核苷酸可以是合成的或者可通過(guò)酶法制成，在一些實(shí)施方式中，其長(zhǎng)度為30-150個(gè)核苷酸。寡核苷酸可含有核糖核苷酸單體(即，可以是寡核糖核苷酸)或脫氧核糖核苷酸單體。例如，寡核苷酸的長(zhǎng)度可以為10-20、11-30、31-40、41-50、51-60、61-70,71-80,80-100,100-150或150-200個(gè)核苷酸。在某些情況下，可如下制得寡核苷酸的群體:利用原位合成方法制造寡核苷酸陣列，以及從基底切割寡核苷酸。所述方法的實(shí)例描述于例如 Cleary 等人(Nature Methods 20041:241-248)和 LeProust 等人(NucleicAcids Research 201038:2522-2540)中。
[0023]本文所使用的術(shù)語(yǔ)“引物”指在純化的限制消化物中天然存在的或者通過(guò)合成產(chǎn)生的寡核苷酸，當(dāng)被放置在與核酸鏈互補(bǔ)的引物延伸產(chǎn)物的合成被誘導(dǎo)的條件下時(shí)，即存在核苷酸和誘導(dǎo)劑(例如DNA聚合酶)且處于合適的溫度和pH時(shí)，其能夠擔(dān)當(dāng)合成起始點(diǎn)。引物可以是單鏈的或雙鏈的，但必須足夠長(zhǎng)以在誘導(dǎo)劑存在時(shí)啟動(dòng)期望延伸產(chǎn)物的合成。引物的確切長(zhǎng)度將取決于許多因素，包括溫度、引物來(lái)源和方法的使用。例如，對(duì)于診斷應(yīng)用，取決于靶序列的復(fù)雜性，寡核苷酸引物典型地含有15-25個(gè)或更多核苷酸，盡管它可含有更少核苷酸。本文的引物被選擇為與特定靶DNA序列的不同鏈基本上互補(bǔ)。這意味著:引物必需足夠互補(bǔ)以與它們各自的鏈雜交。因此，引物序列不需要反映模板的確切序列。例如，非互補(bǔ)的核苷酸片段可被連接到引物的5’末端，而引物序列的其余部分與鏈互補(bǔ)?；蛘?，非互補(bǔ)堿基或更長(zhǎng)序列可散布在引物中，條件是:引物序列與鏈序列足夠互補(bǔ)以與其雜交并從而形成合成延伸產(chǎn)物的模板。
[0024]術(shù)語(yǔ)“雜交”指的是下述過(guò)程，其中核酸鏈在正常雜交條件下與第二互補(bǔ)核酸鏈退火并形成穩(wěn)定雙鏈體(同雙鏈體或異雙鏈體)，且在相同的正常雜交條件下不與無(wú)關(guān)的核酸分子形成穩(wěn)定雙鏈體。在雜交反應(yīng)中，通過(guò)使兩條互補(bǔ)的核酸鏈退火來(lái)實(shí)現(xiàn)雙鏈體的形成?？赏ㄟ^(guò)調(diào)節(jié)雜交反應(yīng)發(fā)生的雜交條件(通常被稱為雜交嚴(yán)格性)使雜交反應(yīng)高度特異，從而，除非兩條核酸鏈含有基本上或完全互補(bǔ)的一定數(shù)目的特定序列核苷酸，否則兩條核酸鏈之間的雜交將不形成穩(wěn)定雙鏈體，例如在正常嚴(yán)格性條件下保留雙鏈性(double-strandedness)區(qū)域的雙鏈體。對(duì)于任何給出的雜交反應(yīng)，“正常雜交或正常嚴(yán)格性條件”易于確定。參見(jiàn)，例如，Ausubel等人，Current Protocols in MolecularB1logy, John ffiley&Sons, Inc., New York，或 Sambrook 等人，Molecular Cloning:ALaboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press。本文使用的術(shù)語(yǔ)“雜交”指的是任何下述過(guò)程，通過(guò)所述過(guò)程核酸鏈通過(guò)堿基配對(duì)與互補(bǔ)鏈結(jié)合。
[0025]如果核酸與參考核酸序列在中度至高度嚴(yán)格性雜交和洗滌條件下特異性相互雜交，那么認(rèn)為這兩種序列“選擇性可雜交”。中度和高度嚴(yán)格性雜交條件是已知的(參見(jiàn)，例如，Ausubel,等人，Short Protocols in Molecular B1logy,第 3 版，Wiley&Sons 1995和 Sambrook 等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第 3 版，2001Cold SpringHarbor, N.Y.) 0高度嚴(yán)格性條件的一個(gè)實(shí)例包括在約42C下在50 %甲酰胺、5X SSC、5XDenhardt氏溶液、0.5% SDS和100 μ g/mL變性運(yùn)載體DNA中雜交，隨后在室溫下在2X SSC和0.5% SDS中洗滌2次并在42°C下在0.1X SSC和0.5% SDS中額外洗滌2次。
[0026]本文所使用的術(shù)語(yǔ)“互補(bǔ)”表示兩種核酸(例如，DNA或RNA)含有能夠形成匹配的沃森-克里克堿基對(duì)從而產(chǎn)生雙鏈區(qū)(除了在錯(cuò)配區(qū))的一系列連續(xù)核苷酸。因此，一條核酸鏈中的腺嘌呤與相對(duì)的互補(bǔ)DNA鏈中的胸腺嘧啶或相對(duì)的互補(bǔ)RNA鏈中的尿嘧啶配對(duì)，一條核酸鏈中的鳥(niǎo)嘌呤與相對(duì)的核酸鏈中的胞嘧啶配對(duì)。配對(duì)區(qū)域被稱為“雙鏈體”?；蛘?，如果兩種核酸分子能夠足夠穩(wěn)定地相互雜交以允許它們?cè)谥辽俪Ｒ?guī)“低嚴(yán)格性”條件下保持相互退火，則它們被稱為“互補(bǔ)”。因此，兩種互補(bǔ)的分子不需要展示出精確的互補(bǔ)性，而僅需序列足夠互補(bǔ)以能形成穩(wěn)定雙鏈結(jié)構(gòu)。因此，偏離完全互補(bǔ)性是可以允許的，只要這種