自2號染色體的序列的結(jié)點來定義重排的斷點。
[0058]以下說明解釋了本公開中所使用的式。本文所述的某些多核苷酸可通過式(例如，13-3’”/%’ -B’ -3’IPI1-B-V2")來指代。所述式遵循已建立的規(guī)范:即它們描述了以5’到3’方向定向的多核苷酸。式的組分(例如，“和“V2’”)指的是多核苷酸內(nèi)可單獨限定的核苷酸序列，其中所述序列共價連接在一起以使得由式描述的多核苷酸是單個分子。在所述單個分子中，式的組分可彼此緊鄰或彼此隔開。按照慣例，利用上撇號(’)來表示式中所顯示序列的互補物，因此序列“v2”的互補物為“v2’”。此外，除非另有說明(例如，如果式之后是“3’ (例如在或“V2’ -B’ -3’”的情況下)或者如果式之前是“5’ _”)，由式限定的多核苷酸可在其3’末端、其5’末端或3’和5’兩末端具有額外序列。其它的術(shù)語定義可出現(xiàn)在說明書全文中。在式的語境中，術(shù)語核酸序列指的是式的組分的核苷酸序列。例如，短語“核酸序列B”指的是組分B的核苷酸序列。
[0059]示例性實施方式說明
[0060]在描述多種實施方式之前，應該理解:本公開的教導不限于所述特定實施方式，并因而當然可以變化。還應該理解:本文中所用術(shù)語僅為了描述【具體實施方式】，并沒有意圖是限制性的，因為本教導的范圍將僅由所附的權(quán)利要求限定。
[0061]本文所使用的節(jié)標題僅為了組織目的，其不應以任何方式被解釋為限制被描述的主題。雖然結(jié)合多種實施方式描述本教導，但這并不意味著本教導限于這些實施方式。相反地，本教導包含本領域技術(shù)人員理解的各種替代選擇、改變和等價物。
[0062]除非另外定義，本發(fā)明使用的所有技術(shù)和科學術(shù)語具有與本公開所屬的技術(shù)領域的普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。盡管與本文描述的那些方法和材料相似或等同的任何方法和材料也能夠用于本教導的實踐或檢測，但現(xiàn)在描述一些示例性的方法和材料。
[0063]對任何出版物的引用是其在申請日前的公開，并不應當解釋為承認本權(quán)利要求無權(quán)憑借著在先發(fā)明早于這種公開。此外，所提供的出版物的日期可不同于實際公開日期，其可獨立確認。
[0064]正如本領域技術(shù)人員在閱讀該公開后顯而易見的，本文描述的和示例的每個單獨的實施方案有分離的組成和特征，其可以容易地與任何其它幾種實施方案的特征分開或組合而不脫離本教導的范圍或精神。任何記載的方法可以以記載的事件順序進行或邏輯上可行的任何其它順序進行。
[0065]本文引用的所有專利和出版物，包括這些專利和出版物中公開的所有序列，通過引用被清楚并入本文。
[0066]方法
[0067]圖1中闡釋了本方法的一般原理。在某些實施方式中，該方法包括:使包含具有下式1-B-3’的頂鏈序列的寡核苷酸2的第一群體與包含具有下式V2’ -B’ -3’的底鏈序列的寡核苷酸4的第二群體雜交以提供雙鏈體6的群體，其中，B和B’序列相互雜交且1和V序列保持為單鏈。在該實施方式中，寡核苷酸的第一和第二群體的特征在于B和B’的核苷酸序列互補且它們的長度為至少15個核苷酸(這允許寡核苷酸的第一和第二群體雜交)第一群體的每種寡核苷酸的B的核苷酸序列是不可變的，即是相同的，第二群體的每種寡核苷酸的B’的核苷酸序列是不可變的，即是相同的的核苷酸序列在的第一群體的寡核苷酸之間是可變的；iv.V2’的核苷酸序列在的第二群體的寡核苷酸之間是可變的；和V.VjPV 2’與參考基因組中的不同位點雜交。B和B’不與參考基因組雜交。雙鏈體6產(chǎn)生之后，使雙鏈體中寡核苷酸的3’末端延伸以產(chǎn)生包含具有下式V1-B-Vd^頂鏈序列10的雙鏈產(chǎn)物8的群體。將由圖1顯而易見的是互補且％與￥2’互補。所得至I撤產(chǎn)物的群體具有下式V1-B-V2的頂鏈，其中，⑴每條頂鏈的核酸序列B是相同的；(ii)群體中的核酸序列V1隨分子而異；(iii)群體中的核酸序列V2隨分子而異；且(iv)在每種產(chǎn)物內(nèi)，Vjp V2序列與參考基因組中的不同位點雜交。在某些實施方式中，在延伸步驟中僅需要進行I輪引物延伸。在另一些實施方式中，可進行若干(例如，2、3、4或5或更多)輪引物延伸(其中，每輪引物延伸包括變性、引物再退火和引物延伸)。在一些情況下，延伸包括少于10輪引物延伸。
[0068]圖2中顯示了方法的一些原理。在該實施方式中，寡核苷酸2的第一群體包含兩種寡核苷酸，所述兩種寡核苷酸含有不同的V1序列(V 13和V lb)和相同的序列B ;且寡核苷酸4的第二群體包含兩種寡核苷酸，所述兩種寡核苷酸含有不同的V序列(V2a’和V2b’ )和相同的序列B’。以使得每種第一寡核苷酸與每種第二寡核苷酸成對組合的方式使寡核苷酸的第一和第二群體雜交在一起，從而產(chǎn)生雙鏈體6的群體。如所示，雙鏈體6的群體含有4種雙鏈體，每種代表第一和第二寡核苷酸的不同組合，它們通過它們的B/B’序列雜交在一起。然后，使雙鏈體延伸以產(chǎn)生雙鏈產(chǎn)物8的群體，其中每種產(chǎn)物具有不同的頂鏈。具體地，如所示，第一雙鏈產(chǎn)物8a具有含有Vla和V 2a序列的組合的頂鏈，第二雙鏈產(chǎn)物8b具有含有Vlb和V 2a序列的組合的頂鏈，第三雙鏈產(chǎn)物8c具有含有V 13和V 2b序列的組合的頂鏈，且第四雙鏈產(chǎn)物8d具有含有Vlb和V 2b序列的組合的頂鏈。
[0069]在某些情況下，在產(chǎn)物分子內(nèi)，VJPV2序列與參考基因組中相隔一定距離的位點雜交，所述距離使得很難或不可能通過聚合酶鏈式反應常規(guī)獲得產(chǎn)物。在任何一種第一寡核苷酸分子中，1和V 2序列可分別與相同染色體的長臂和短臂雜交，或者相反。在另一些實施方式中，在任何一種產(chǎn)物分子中，VjP V2序列可與不同染色體雜交(例如，乂1序列可與I號染色體雜交且^序列可與2號染色體雜交)。在另一些情況下，與V JP V 2雜交的位點在參考基因組中相距至少10kb，但在某些實施方式中，該距離可較短，例如，至少2kb或至少5kb。在某些情況下，在每種第一寡核苷酸內(nèi)，與VJP V 2雜交的序列可在參考基因組中相距至少20kb、至少50kb、至少10kb或至少500kb。
[0070]在某些情況下，VjP V 2’序列可被設計以使得產(chǎn)物分子中的VJP V 2序列緊挨著參考基因組中的限制位點雜交。序列VpB和V2’各自的長度為至少15個核苷酸。在一些實施方式中，序列VpB和V2’的長度可獨立地為至少18個核苷酸、至少20個核苷酸、至少25個核苷酸、至少30個核苷酸、直至50個核苷酸或更多。將顯而易見的是，VJPV 2’的序列彼此獨立地不同。
[0071]在某些實施方式中，第一寡核苷酸的群體的寡核苷酸可被設計以使得群體的1序列與這樣的位點雜交，所述位點全部在參考基因組的第一區(qū)域中的一條鏈中(例如，在貫穿50kb或10kb的區(qū)域分布(例如平鋪(tiled through))的位點);且第二寡核苷酸的群體的寡核苷酸的V序列與這樣的位點雜交，所述位點全部在參考基因組的第二區(qū)域中的一條鏈中(例如，在貫穿50kb或10kb的區(qū)域分布(例如平鋪)的位點)。在某些情況下，第一和第二區(qū)域可已知在其它基因組中相互重排。
[0072]在一些實施方式中和如圖3中所示，寡核苷酸12的第一群體可包含具有下式F-VfB-3’的頂鏈序列，寡核苷酸14的第二群體可包含具有下式R’ -V -B’ -3’的底鏈序列，且雙鏈產(chǎn)物的群體可包含具有下式F-V1-B-V2-R的頂鏈18，其中R和F的互補物(即，F(xiàn)’)提供正向引物20和反向引物22的結(jié)合位點。如所示，該方法還可包括:使用正向引物20和反向引物22，PCR擴增雙鏈產(chǎn)物18的群體以產(chǎn)生雙鏈PCR產(chǎn)物24的群體，所述雙鏈PCR產(chǎn)物24包含具有式F-V1-B-V2-R的頂鏈的頂鏈26序列。
[0073]在使用之前，在某些情況下，雙鏈PCR產(chǎn)物24的群體可被處理以產(chǎn)生式F-V1-B-V2-R的單鏈產(chǎn)物28的群體。例如，這可如下來實現(xiàn):使用5’-磷酸化(通過反向引物22中的星號來指示)的反向引物和未5’磷酸化的正向引物，然后通過使用選擇性降解5’_磷酸化核酸的核酸外切酶來降解雙鏈產(chǎn)物的群體的底鏈以產(chǎn)生單鏈產(chǎn)物。λ核酸外切酶是這類酶的一個例子，但也存在其它這類酶。在一個替代性實施方式中，反向引物可被生物素化，雙鏈PCR產(chǎn)物24的底鏈可例如通過使所述雙鏈產(chǎn)物變性并使生物素化的底鏈與例如鏈霉親和素結(jié)合而被除去。圖4闡釋了通過該方法產(chǎn)生的含有3種示例性單鏈產(chǎn)物(單鏈產(chǎn)物30a、30b和30c)的群體。如圖4中所示，每種單鏈產(chǎn)物的核酸序列B是相同的且與一種或多種第二寡核苷酸雜交(未不出)。在所顯不的分子中，單鏈產(chǎn)物30a、30b和30c的5’末端分別具有不同的序列VlaJ1JP V:。，且第一寡核苷酸30a、30b和30c的3’末端分別具有不同的序列V2a、V2JPV 2。。
[0074]寡核苷酸的第一和第二群體中各種寡核苷酸區(qū)域的長度可變化很大，這取決于期望的應用和寡核苷酸中含有多少載量(freight) ( S卩，多少引物結(jié)合位點、分子條碼等)。例如，如下文所述，在某些情況下，B區(qū)域可為至少一對PCR引物提供位點，并任選地提供一個或多個分子條碼。在某些實施方式中，B的核苷酸序列的長度為至少15個堿基，例如20-100個堿基或30-60個堿基；且VjP V 2’的序列的長度可為至少10個核苷酸，例如10-100個堿基或15-50個堿基。
[0075]寡核苷酸的第一和第二群體各自的成員數(shù)目可變化很大，這取決于如何實施方法。在一些實施方式中，寡核苷酸的第一和第二群體可含有至少10個、至少50個、至少100個、至少200個、至少500個或至少1000個以及多達10000個或更多個成員。此外，任何一種組裝體可含有通過不同的B序列雜交的多對寡核苷酸的群體。例如，通過序列B2雜交的寡核苷酸第三和第四的群體可在與通過序列B1雜交的寡核苷酸的第一和第二群體相同的反應中組裝。上述方法可使用至少I對、至少2對、至少5對、至少10對或至少100對或更多對寡核苷酸的群體來完成，其中每個群體與成對的另一群體雜交。
[0076]單鏈產(chǎn)物26的群體用作多重暈環(huán)試驗中的第一寡核苷酸，其中，在本公開的語境中，多重暈環(huán)試驗使用第一寡核苷酸(任選地，其可包含V1區(qū)域的5’非雜交序列和V2區(qū)域的3’非雜交序列)的群體和與區(qū)域B雜交的一種或多種第二寡核苷酸。為了參考目的，圖5中顯示了暈環(huán)探針的兩種實施方式:32和46。如圖5中所示，暈環(huán)探針的兩種實施方式32和46均包含:第一寡核苷酸34，其包含與片段靶DNA中的不同區(qū)域雜交的側(cè)翼序列38和40，以及中心序列42。側(cè)翼序列38對應于在本文中被稱為“V/’的區(qū)域，側(cè)翼序列40對應于在本文中被稱為“V2”的區(qū)域，中心序列42對應于在本文中被稱為“B”的區(qū)域。如所