偏離不足以完全阻礙雜交形成雙鏈結(jié)構(gòu)即可。
[0027]本文所使用的術(shù)語“雙鏈體(duplex) ”或“雙鏈化的(duplexed) ”描述了兩個(gè)堿基配對(duì)(即，雜交在一起)的互補(bǔ)多核苷酸。
[0028]本文所使用的術(shù)語“擴(kuò)增”指的是合成與模板核酸的一條鏈或兩條鏈互補(bǔ)的核酸分子的過程。擴(kuò)增核酸分子典型地包括:使模板核酸變性，使引物與模板核酸在低于引物恪解溫度的溫度下退火，以及酶促地從引物延伸以產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物?？蛇M(jìn)行一次變性、退火和延伸步驟中的每一個(gè)。然而，一般進(jìn)行變性、退火和延伸步驟多次(例如，至少5或10次，多至30或40次或更多次)以使擴(kuò)增產(chǎn)物的量增加，通常指數(shù)倍增加，盡管本發(fā)明的方法不需要指數(shù)擴(kuò)增。擴(kuò)增典型地需要脫氧核糖核苷三磷酸、DNA聚合酶和合適緩沖液和/或有利于聚合酶最佳活性的輔助因子的存在。術(shù)語“擴(kuò)增產(chǎn)物”指的是由本文所定義的擴(kuò)增過程產(chǎn)生的核酸序列。
[0029]本文所使用的術(shù)語指的是寡核苷酸雙鏈體中一半的雙鏈體保持雜交且一半的雙鏈體解離成單鏈時(shí)的熔解溫度。寡核苷酸雙鏈體的Tni可通過實(shí)驗(yàn)被測(cè)定或使用下式預(yù)測(cè) -Tni= 81.5+16.6 (log1Q[Na+] )+0.41 (G+C 部分)-(60/N)，其中 N 是鏈長(zhǎng)，[Na+]小于 IM0參見 Sambrook 和 Russell (2001 ；Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第 3版，ColdSpring Harbor Press, Cold Spring Harbor N.Y.,第 10 章)。存在用于預(yù)測(cè)寡核昔酸雙鏈體的Tni的其它公式，一個(gè)公式可以或多或少地適合于給定的條件或條件集合。
[0030]本文所使用的術(shù)語“游離于溶液(free in solut1n) ”描述了未與另一分子結(jié)合或被其牽制的分子，例如多核苷酸。
[0031]本文所使用的術(shù)語“連接”指的是酶促催化地結(jié)合第一 DNA分子5’末端的末端核苷酸與第二 DNA分子3’末端的末端核苷酸。
[0032]術(shù)語“多個(gè)/種”、“群體”和“集合”在本文中可互換使用，其指的是包含至少2個(gè)/種成員的某物。在某些情況下，多個(gè)/種、群體或集合可具有至少10、至少100、至少1000、至少10000、至少100000、至少106、至少107、至少18或至少10 9或更多個(gè)/種成員。
[0033]如果兩種核酸“互補(bǔ)”，那么它們?cè)诟叨葒?yán)格性條件下相互雜交。術(shù)語“完美互補(bǔ)”被用來描述下述雙鏈體，其中一種核酸的每個(gè)堿基與另一種核酸中的互補(bǔ)核苷酸堿基配對(duì)。在許多情況下，互補(bǔ)的兩種序列具有至少10 (例如至少12或15)個(gè)互補(bǔ)的核苷酸。
[0034]術(shù)語“消化”旨在表示下述過程，通過所述過程核酸被限制酶切割。為了消化核酸，使限制酶與含有限制酶的識(shí)別位點(diǎn)的核酸在適合限制酶起作用的條件下接觸。適合市售限制酶活性的條件是已知的并且購(gòu)買后隨這些酶被提供。
[0035]寡核苷酸“結(jié)合位點(diǎn)”指的是靶多核苷酸中與寡核苷酸雜交的位點(diǎn)。如果寡核苷酸“提供”引物的結(jié)合位點(diǎn)，那么引物可與該寡核苷酸或其互補(bǔ)物雜交。
[0036]本文所使用的術(shù)語“鏈”指的是由通過共價(jià)鍵(例如磷酸二酯鍵)共價(jià)連接在一起的核苷酸構(gòu)成的核酸。
[0037]在細(xì)胞中，DNA通常以雙鏈形式存在，并因而具有兩條互補(bǔ)的核酸鏈，在本文中被稱為“頂”和“底”鏈。在某些情況下，染色體區(qū)域的互補(bǔ)鏈可被稱為“正”鏈和“負(fù)”鏈、“第一”鏈和“第二”鏈、“編碼”鏈和“非編碼”鏈、“Watson”鏈和“Crick”鏈或者“正義”鏈和“反義”鏈。鏈被分配成頂鏈或底鏈?zhǔn)侨我獾模⒎前凳救魏翁囟ǖ姆较?、功能或結(jié)構(gòu)。一些示例性的哺乳動(dòng)物染色體區(qū)域(例如BAC、組裝體、染色體等)的第一鏈的核苷酸序列是已知的，并且可在例如NCBI的Genbank數(shù)據(jù)庫中找到。
[0038]本文所使用的術(shù)語“頂鏈”指的是核酸的任何一條鏈，但并非核酸的兩條鏈。當(dāng)寡核苷酸或引物“僅與頂鏈”結(jié)合或退火時(shí)，它僅與一條鏈結(jié)合而不與另一條鏈結(jié)合。本文所使用的術(shù)語“底鏈”指的是與“頂鏈”互補(bǔ)的鏈。當(dāng)寡核苷酸“僅與一條鏈”結(jié)合或退火時(shí)，它僅與一條鏈(例如，第一鏈或第二鏈)結(jié)合而不與另一條鏈結(jié)合。
[0039]本文所使用的術(shù)語“變性”指的是通過將核酸雙鏈體放置在合適的變性條件下來使所述雙鏈體的至少部分堿基對(duì)分開。變性條件在本領(lǐng)域眾所周知。在一種實(shí)施方式中，為了使核酸雙鏈體變性，可將該雙鏈體暴露于高于雙鏈體的Tm的溫度，從而使該雙鏈體的一條鏈從另一條鏈釋放。在某些實(shí)施方式中，可通過將核酸暴露于至少90°C的溫度持續(xù)合適量的時(shí)間(例如，至少30秒，多達(dá)30分鐘)來使其變性。在某些實(shí)施方式中，可使用完全變性條件來完全分開雙鏈體的堿基對(duì)。在另一些實(shí)施方式中，可使用部分變性條件(例如，利用低于完全變性條件的溫度)來分開雙鏈體某些部分的堿基對(duì)(例如，富含A-T堿基對(duì)的區(qū)域可分開，而富含G-C堿基對(duì)的區(qū)域可保持配對(duì))。核酸還可被化學(xué)變性(例如，使用尿素或NaOH)。
[0040]本文所使用的術(shù)語“延伸”指的是通過使用聚合酶添加核苷酸來延伸引物。如果與核酸退火的引物被延伸，那么所述核酸擔(dān)當(dāng)延伸反應(yīng)的模板。
[0041]本文所使用的術(shù)語“環(huán)化”指的是連接一個(gè)或多個(gè)線性分子以產(chǎn)生無游離的3’或5’末端的閉環(huán)形式的鏈。
[0042]本文所使用的術(shù)語“特有(unique)序列”指的是這樣的核苷酸序列，它們彼此或與它們的互補(bǔ)物不同。例如，第一特有序列具有不同于第二特有序列或其互補(bǔ)物的核苷酸序列。除非另有說明，在樣品中，特有序列僅存在于一種多核苷酸中。
[0043]在不相互雜交的核酸的語境中，本文所使用的術(shù)語“不相互雜交”指的是這樣的序列，其已被設(shè)計(jì)以使它們?cè)趪?yán)格條件下不相互退火。這類序列的例子在例如US20070259357和Brenner等人(Proc.Natl.Acad.Sc1.199289:5381-3)中所述的某些出版物中被稱為“序列記號(hào)”，上述通過引用被并入本文。
[0044]在彼此緊鄰的兩核苷酸的語境中，術(shù)語“緊鄰”表示:所述兩核苷酸之間沒有插入的核苷酸?？墒贡舜司o鄰的核苷酸彼此相連。
[0045]在多核苷酸或多肽的語境中，術(shù)語“彼此相似”表示彼此至少70%相同、至少80%相同、至少90%相同或至少95%相同的序列。
[0046]術(shù)語“單鏈”指的是以單鏈形式而非雙鏈形式存在于組合物中的核酸鏈。在某些情況下，單鏈多核苷酸可在不存在任何互補(bǔ)多核苷酸時(shí)存在于組合物中。在另一些情況下，例如，在已變性的雙鏈核酸未復(fù)性的情況下，單鏈多核苷酸可存在于還包含互補(bǔ)多核苷酸的組合物中。然而，在這些情況下，多核苷酸相互之間不堿基配對(duì)。
[0047]在相同的兩種或多種序列的語境中，術(shù)語“相同”指的是具有相同核苷酸序列的兩種或多種核酸。換言之，如果群體的所有多核苷酸具有相同的序列，則群體的所有多核苷酸分子具有相同的核苷酸序列。
[0048]術(shù)語“接觸”表示放在一起。因此，當(dāng)將第一物品與第二物品放在一起時(shí)，例如通過使它們相互觸及或使它們?cè)谙嗤芤褐薪M合，這兩個(gè)物品接觸。因此，“接觸的樣品”是寡核苷酸探針已與其雜交的檢測(cè)染色體。
[0049]本文所使用的術(shù)語“基因分型”指的是任何類型的核酸序列分析，其包括測(cè)序、多態(tài)性分析(例如，SNP分析)和鑒定重排的分析。
[0050]本文所使用的術(shù)語“測(cè)序”指的是下述方法，通過所述方法獲得多核苷酸的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸的鑒定(例如至少20個(gè)、至少50個(gè)、至少100個(gè)或至少200個(gè)或更多連續(xù)核苷酸的鑒定)。
[0051]術(shù)語“下一代測(cè)序”指的是Illumina、Life Technologies和Roche等目前采用的所謂并行化的邊合成邊測(cè)序或邊連接邊測(cè)序平臺(tái)。下一代測(cè)序方法還可包括納米孔測(cè)序方法或基于電子檢測(cè)的方法例如被Life Technologies商業(yè)化的離子激流(1n Torrent)技術(shù)。
[0052]本文所使用的術(shù)語“條碼序列”或“分子條碼”指的是特有的核苷酸序列，其被用來:a)鑒定和/或追蹤反應(yīng)中多核苷酸的來源，和/或b)計(jì)算初始分子被測(cè)序多少次(例如，在基本樣品中的每個(gè)分子被不同序列標(biāo)簽化，然后擴(kuò)增該樣品的情況下)。條碼序列可位于寡核苷酸的5’末端、3’末端或中間。條碼序列的尺寸和組成可廣泛變化；下列參考文獻(xiàn)提供了選擇適合特定實(shí)施方式的條碼序列集合的指導(dǎo):Brenner,美國(guó)專利號(hào) 5, 635, 400 ；Brenner 等人,Proc.Natl.Acad.Sc1., 97:1665-1670(2000) ；Shoemake等人，Nature Genetics, 14:450-456 (1996) ;Morris 等人，歐洲專利公開 0799897A1 ;Wallace,美國(guó)專利號(hào)5，981，179 ;等等。在一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，條碼序列的長(zhǎng)度可在4_36個(gè)核苷酸，或6-30個(gè)核苷酸，或8-20個(gè)核苷酸的范圍內(nèi)。
[0053]本文所使用的術(shù)語“PCR試劑”指的是在模板上進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)所需的所有試劑。如本領(lǐng)域所知，PCR試劑基本上包括第一引物、第二引物、熱穩(wěn)定性聚合酶和核苷酸。取決于使用的聚合酶，離子(例如，Mg2+)也可存在。PCR試劑可任選地含有模板，靶標(biāo)序列可從所述模板擴(kuò)增。
[0054]在可變的兩種或多種核酸序列的語境中，術(shù)語“可變的”指的是相對(duì)于彼此具有不同核苷酸序列的兩種或多種核酸。換言之，如果群體的多核苷酸具有可變的序列，則群體的多核苷酸分子的核苷酸序列隨分子而異。術(shù)語“可變的”不應(yīng)被解讀為需要群體中的每個(gè)分子具有不同于的群體中其它分子的序列。術(shù)語“可變的”表示:序列在群體的不同分子之間不同，且可以存在任何特定序列的重復(fù)。
[0055]本文所使用的術(shù)語“參考基因組”指的是可將獲自檢測(cè)基因組的結(jié)果與其比較的基因組。在某些情況下，所研究的區(qū)域可以是參考基因中的已知核苷酸序列，例如，序列可已被儲(chǔ)存在例如NCBI的Genbank數(shù)據(jù)庫或其它數(shù)據(jù)庫中。在許多實(shí)施方式中，檢測(cè)基因組和參考基因組是來自相同(例如，哺乳動(dòng)物)物種的基因組。
[0056]本文所使用的術(shù)語“染色體重排”指的是這樣的事件，其中染色體的一部分或更多部分在單個(gè)染色體之內(nèi)或在染色體之間重排。在某些情況下，染色體重排可反映染色體結(jié)構(gòu)的異常。染色體重排可以是例如，倒位、缺失、插入或易位。
[0057]在染色體重排的語境中，術(shù)語“斷點(diǎn)”指的是通過染色體重排產(chǎn)生的結(jié)點(diǎn)。例如，如果I號(hào)染色體和2號(hào)染色體之間存在重排，則通過重排的染色體中來自I號(hào)染色體的序列和來