的互補(bǔ)物提供正向引物和反向引物的結(jié)合位點(diǎn)。此外，試劑盒還包含與序列F和R’的互補(bǔ)物雜交的正向引物和反向引物。在某些情況下，正向引物和反向引物之一可包含5’磷酸或生物素。此外，試劑盒還可包含用于進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)浇M裝的試劑(例如，聚合酶、核苷酸和緩沖液等)和用于進(jìn)行所述方法的其它酶和/或試劑(例如，連接酶、λ核酸外切酶等)。根據(jù)期望，試劑盒的各種組分可出現(xiàn)在分開的容器中或者某些相容組分可被預(yù)先組合在單個容器中。
[0092]除了上述組分之外，本試劑盒還可包含關(guān)于使用所述試劑盒的組分來實(shí)行本方法的說明(即，提供樣品分析說明)。實(shí)行本方法的說明通常記錄在合適的記錄介質(zhì)上。例如，說明可被印刷在基質(zhì)(例如紙或塑料，等)上。因而，說明可作為包裝插入物(insert)出現(xiàn)在試劑盒中，在試劑盒或其組分的容器標(biāo)記中(即，與包裝或小包裝相關(guān))等。在另一些實(shí)施方式中，說明作為存在于合適的計(jì)算機(jī)可讀存儲介質(zhì)(例如，CD-ROM、磁盤等)上的電子存儲數(shù)據(jù)文件被呈現(xiàn)。在又一些實(shí)施方式中，實(shí)際說明未出現(xiàn)在試劑盒中，但從遠(yuǎn)程來源(例如，通過因特網(wǎng))獲得說明的方法被提供。這種實(shí)施方式的一個實(shí)例是包括網(wǎng)址的試劑盒，其中可在所述網(wǎng)址查看說明并/或可從所述網(wǎng)址下載說明。與說明一樣，這種獲得說明的方法被記錄在合適基質(zhì)上。
[0093]應(yīng)思
[0094]上文所述的多重暈環(huán)試驗(yàn)可用于多種應(yīng)用，其中所述應(yīng)用通常包括可檢測到給定樣品中染色體重排存在的基因組DNA分析應(yīng)用。本方法還可用于精細(xì)地確定染色體斷點(diǎn)和其它畸變(例如，微-倒位、缺失和易位)的位置，在某些情況下沒有用關(guān)于它們位置的現(xiàn)有知識。本方法可用于多種診斷和研究目的，因?yàn)槿旧w倒位和易位在與人類疾病相關(guān)的狀況和許多生物體的基因組進(jìn)化中發(fā)揮重要的作用。
[0095]特別地，上述方法可用于診斷或研究多種類型的遺傳異常、癌癥或其它哺乳動物疾病，包括但不限于:白血?。蝗橄侔?；前列腺癌；阿爾茲海默癥；帕金森癥；癲癇；肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥；多發(fā)性硬化；中風(fēng)；自閉癥；貓叫綜合癥(5號染色體的短臂截短)、1ρ36缺失綜合癥(I號染色體的部分短臂缺失)、安格爾曼綜合癥(15號染色體的部分長臂缺失)；普拉德-威利綜合癥(15號染色體的部分短臂缺失)；急性淋巴細(xì)胞白血病和更特別地，慢性髓細(xì)胞性白血病(9號染色體和22號染色體之間易位)；腭心面綜合癥(22號染色體的部分長臂缺失)；特納綜合癥(單個X染色體)；克蘭費(fèi)爾特綜合癥(額外的X染色體)；愛德華綜合癥(三體型18號染色體)；唐氏綜合癥(三體型21號染色體)；帕韜氏綜合癥(三體型13號染色體)；和三體型8、9和16號，其通常無法存活至出生。
[0096]所述疾病可以是遺傳的(生殖細(xì)胞突變)或偶發(fā)的(體細(xì)胞突變)。本文所述的許多示例性染色體重排與產(chǎn)生這些疾病的因素相關(guān)和被認(rèn)為是產(chǎn)生這些疾病的因素。知曉染色體重排的類型和位置可大大有助于多種哺乳動物疾病的診斷、預(yù)后和理解。
[0097]某些上述方法還可用于檢測患病細(xì)胞，其比需要分裂細(xì)胞并需要技術(shù)人員勞動和耗時的人工制備以及技術(shù)人員對載片的分析的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞遺傳學(xué)方法更為容易。
[0098]上述方法還可用于比較兩個生物物種的基因組以推斷進(jìn)化關(guān)系。
[0099]基因組DNA可分離自多種來源，包括組織培養(yǎng)細(xì)胞和哺乳動物對象，例如，人類、靈長動物、小鼠或大鼠對象。例如，可由少于5毫升(mL)外周血分析染色體。白血細(xì)胞含有染色體而紅血細(xì)胞不含染色體。可收集血液并將其與抗凝劑(例如，肝素鈉)合并。還可由羊水(其含有胎兒細(xì)胞)分析基因組DNA?？墒惯@類細(xì)胞在組織培養(yǎng)物中生長以使得在5-10天內(nèi)能夠獲得用于染色體分析的分裂細(xì)胞。還可由骨髓分析基因組DNA，這有利于白血病或其它骨髓癌癥的診斷。還可由固體組織樣品分析基因組DNA?？蔁o菌獲得在約2-3mm范圍內(nèi)的皮膚或其它組織活檢樣本并將其轉(zhuǎn)移至含有無菌鹽水或組織轉(zhuǎn)運(yùn)介質(zhì)的無菌小瓶中以提供用于染色體分析的材料。流產(chǎn)后獲得的胎兒組織也可用于染色體分析，例如來自胎盤的胎兒側(cè)、覆蓋胸骨的骨膜或腹股溝韌帶之上的筋膜，或來自絨膜絨毛。胎兒組織還可收集自多個位點(diǎn)，例如腎臟、胸腺、肺、隔膜、肌肉、腱和生殖腺。還可以進(jìn)行羊膜穿刺術(shù)。
[0100]除了上述之外，本方法還可對例如骨髓涂片、血液涂片、石蠟包埋的組織制品、酶促分離的組織樣品、非培養(yǎng)的骨髓、非培養(yǎng)羊水細(xì)胞和細(xì)胞離心制品進(jìn)行。
實(shí)施例
[0101]在該實(shí)施例中，通過待被暈環(huán)探針靶向的基因特異序列是否與靶序列的5’或3’末端互補(bǔ)來鑒定它們并將它們分類。對于與5’末端互補(bǔ)的那些，將通用連接序列添加到探針的3’末端以產(chǎn)生含有基因特異序列和其后的連接序列的嵌合序列。對于靶向靶序列的3’末端的那些探針，生成探針序列的反向互補(bǔ)物并將連接序列的反向互補(bǔ)物添加到3’末端。
[0102]合成每種嵌合寡核苷酸，使它們匯集在一起并通過引物延伸來組裝。然后，通過PCR選擇性擴(kuò)增延伸的探針。在使用該方法時，可通過用所使用5’引物的數(shù)目乘以所使用3’引物的數(shù)目來計(jì)算暈環(huán)探針的數(shù)目。例如，由200個寡核苷酸合成反應(yīng)可生成10000個暈環(huán)探針。圖7顯示了可如何通過引物延伸制造一個暈環(huán)探針。圖8顯示了可如何擴(kuò)展圖7中所示一般原理以制造多個暈環(huán)探針。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種方法，其包括: a)使包含具有下式: VB-3， 的頂鏈序列的寡核苷酸的第一群體與包含具有下式: V-B，-3， 的底鏈序列的寡核苷酸的第二群體雜交以提供雙鏈體的群體；其中: B和B’的核苷酸序列互補(bǔ)且它們的長度為至少15個核苷酸； 所述第一群體的每種寡核苷酸的B的核苷酸序列相同； 所述第二群體的每種寡核苷酸的B’的核苷酸序列相同； V1的核苷酸序列在所述第一群體的寡核苷酸之間是可變的； V的核苷酸序列在所述第二群體的寡核苷酸之間是可變的，且 V1^p V 2?與參考基因組中的位點(diǎn)雜交；和 b)使所述雙鏈體中寡核苷酸的3’末端延伸以產(chǎn)生雙鏈產(chǎn)物的群體，所述雙鏈產(chǎn)物包含具有下式:V1-B-V2 的頂鏈序列，其中^與V2’互補(bǔ)。2.權(quán)利要求1所述的方法，其中: 所述寡核苷酸的第一群體包含具有下式:F-V1-B-3> 的頂鏈序列；所述寡核苷酸的第二群體包含具有下式: R，-V -B，-3， 的底鏈序列；并且所述雙鏈產(chǎn)物的群體包含具有下式:F-V1-B-V2-R 的頂鏈序列，其中F的互補(bǔ)物和R提供正向和反向引物的結(jié)合位點(diǎn)，所述正向和反向引物能夠被用于擴(kuò)增所述雙鏈產(chǎn)物的群體以產(chǎn)生PCR產(chǎn)物的群體。3.權(quán)利要求2所述的方法，其還包括: c)使用所述正向和反向引物PCR擴(kuò)增所述雙鏈產(chǎn)物的群體以產(chǎn)生所述PCR產(chǎn)物的群體。4.權(quán)利要求4所述的方法，其還包括: d)將所述PCR產(chǎn)物的群體的所述頂鏈與底鏈分離以產(chǎn)生與所述基因組中多個位點(diǎn)雜交的單鏈暈環(huán)探針的群體。5.權(quán)利要求4所述的方法，其中所述反向引物是5’-磷酸化的且所述分離通過使用核酸外切酶降解所述雙鏈產(chǎn)物的群體的底鏈來實(shí)現(xiàn)。6.權(quán)利要求5所述的方法，其中所述核酸外切酶是λ核酸外切酶。7.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述基因組是哺乳動物基因組。8.權(quán)利要求1所述的方法，其中B的核苷酸序列的長度為至少15個堿基。9.權(quán)利要求1所述的方法，其中V:和V 2’的核苷酸序列的長度為至少25個核苷酸。10.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述寡核苷酸的第一群體包含至少10種寡核苷酸且所述寡核苷酸的第二群體包含至少10種寡核苷酸。11.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述基因組中與VjPV^交的位點(diǎn)各包含限制位點(diǎn)。12.物質(zhì)的組合物，其包含: 雙鏈體的群體，其中所述雙鏈體包含: 包含具有下式: VB-3， 的頂鏈序列的寡核苷酸的第一群體；和包含具有下式: V-B，-3， 的底鏈序列的寡核苷酸的第二群體；其中: B和B’的核苷酸序列互補(bǔ)且它們的長度為至少15個核苷酸； 所述第一群體的每種寡核苷酸的B的核苷酸序列相同； 所述第二群體的每種寡核苷酸的B’的核苷酸序列相同； V1的核苷酸序列在所述第一群體的寡核苷酸之間是可變的； V的核苷酸序列在所述第二群體的寡核苷酸之間是可變的，且 VJPV2’與參考基因組中的不同位點(diǎn)雜交。13.權(quán)利要求12所述的物質(zhì)的組合物，其中B的核苷酸序列的長度為至少15個堿基。14.權(quán)利要求12所述的物質(zhì)的組合物，其中VJP V 2’的核苷酸序列的長度為至少25個核苷酸。15.權(quán)利要求12所述的物質(zhì)的組合物，其中所述寡核苷酸的第一群體包含至少10種寡核苷酸，且所述寡核苷酸的第二群體包含至少10種寡核苷酸。16.試劑盒，其包含: a)包含具有下式: VB-3， 的頂鏈序列的寡核苷酸的第一群體；和 b)包含具有下式: V-B，-3， 的底鏈序列的寡核苷酸的第二群體；其中: B和B’的核苷酸序列互補(bǔ)且它們的長度為至少15個核苷酸； 所述第一群體的每種寡核苷酸的B的核苷酸序列相同； 所述第二群體的每種寡核苷酸的B’的核苷酸序列相同； V1的核苷酸序列在所述第一群體的寡核苷酸之間是可變的； V的核苷酸序列在所述第二群體的寡核苷酸之間是可變的，且 VJPV2’與參考基因組中的不同位點(diǎn)雜交。17.權(quán)利要求16所述的試劑盒，其還包含用于實(shí)施權(quán)利要求1所述方法的說明。18.權(quán)利要求16所述的試劑盒，其中所述寡核苷酸的第一群體包含具有下式: F-V1-B-3> 的頂鏈序列；且所述寡核苷酸的第二群體包含具有下式: R，-V -B，-3， 的底鏈序列；其中序列F和R’的互補(bǔ)物提供正向和反向引物的結(jié)合位點(diǎn)。19.權(quán)利要求16所述的試劑盒，其還包含與序列F和R’的互補(bǔ)物雜交的正向和反向引 物。20.權(quán)利要求16所述的試劑盒，其中所述正向和反向引物之一包含5’磷酸或生物素。
【專利摘要】本文提供通過引物延伸產(chǎn)生探針庫的方法。在某些實(shí)施方式中，所述方法包括：使包含具有下式V1-B-3’的頂鏈序列的第一寡核苷酸的群體與包含具有下式V2’-B’-3’的底鏈序列的第二寡核苷酸的群體雜交以提供雙鏈體的群體。雜交之后，使雙鏈體中寡核苷酸的3’末端延伸以產(chǎn)生雙鏈產(chǎn)物的群體，所述雙鏈產(chǎn)物包含具有下式V1-B-V2的頂鏈序列，其中V2與V2’互補(bǔ)。
【IPC分類】C12Q1/68, C12N15/11
【公開號】CN105026578
【申請?zhí)枴緾N201380074318
【發(fā)明人】邁克爾·魯沃洛, 艾米麗·馬林·勒普魯
【申請人】安捷倫科技有限公司
【公開日】2015年11月4日
【申請日】2013年3月5日
【公告號】WO2014137329A1