一種使用“一鍋法”標(biāo)記修飾生物大分子的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種使用"一鍋法"標(biāo)記修飾生物大分子的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 在新藥研究過程中，通過化合物活性篩選而獲得具有生物活性的先導(dǎo)化合物是創(chuàng) 新藥物研究的基礎(chǔ)。隨著篩選方法和合成DNA編碼大規(guī)模生物活性化合物庫(kù)用于高通量新 藥篩選（HighThroughputScreening，HTS)的新技術(shù)的發(fā)展，大大加速了先導(dǎo)化合物的尋 找和發(fā)現(xiàn)。高通量新藥篩選需要建立數(shù)目龐大、結(jié)構(gòu)多樣性的小分子化合物鏈接到DNA的 生物大分子上。因此，對(duì)化學(xué)小分子和生物大分子的鏈接反應(yīng)技術(shù)提出了更高的要求。
[0003] ADC藥物是近年來快速發(fā)展的一類綜合了治療性抗體強(qiáng)靶向性和小分子化學(xué)藥物 對(duì)癌細(xì)胞高度殺傷力的新型藥物。ADC藥物由抗體蛋白、化學(xué)藥物及"連接物"（Linker)共 同構(gòu)成。ADC藥物的連接物實(shí)現(xiàn)抗體蛋白與化學(xué)藥物的連接，目前使用化學(xué)共價(jià)鍵（二硫 鍵、肽鍵、硫醚鍵）等來實(shí)現(xiàn)。在ADC藥物進(jìn)入靶細(xì)胞前，鏈接鍵能確保偶聯(lián)藥物的完整性。 而一旦ADC藥物進(jìn)入作用靶點(diǎn)，連接物又要確?；瘜W(xué)藥物的有效釋放?？梢?，構(gòu)建穩(wěn)定性合 適的"連接物"，是目前ADC藥物研發(fā)和產(chǎn)業(yè)化所面臨的一個(gè)主要問題。此外，ADC藥物中 抗體負(fù)載的化學(xué)藥物數(shù)量也取決于連接物。早期的ADC藥物的研發(fā)失敗，多是由于連接物 技術(shù)的落后，其直接影響了ADC藥物的安全性和有效性。
[0004] -價(jià)銅離子Cu(I)催化的炔基和疊氮的1，3_偶極環(huán)加成反應(yīng)目前已被大家熟 知，稱為點(diǎn)擊化學(xué)（ClickChemistry)反應(yīng)，其具有反應(yīng)條件溫和、轉(zhuǎn)化率高、官能團(tuán)耐受 性好和區(qū)域選擇性好等特點(diǎn)（R.Huisgen，l，3_dipolarCycloadditionChemistry,Wiley: NewYork, 1984 ；K.B.Sharpless,etal,Angew.Chem.Int.Ed. 2002, 41, 2596 - 2599 ； K.B.Sharpless,etal,Angew.Chem.Int.Ed. 2001，40, 2004 - 2021.) 〇
[0005] 點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)是生物兼容性的反應(yīng)，反應(yīng)底物及產(chǎn)物對(duì)生物大分子（蛋白質(zhì)、核 酸及糖類等）以及細(xì)胞的活性沒有影響，反應(yīng)條件溫和，可以進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)等。因此，在 藥物化學(xué)、分子生物學(xué)和生物化學(xué)等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。目前，點(diǎn)擊反應(yīng)已經(jīng)廣泛 地在小分子藥物合成，生物大分子類如蛋白質(zhì)、DNA、糖類，以及體內(nèi)活細(xì)胞的修飾標(biāo)記等 領(lǐng)域，得到 了很大的發(fā)展和應(yīng)用（C.R.Bertozzi，etal,Science2000, 287, 2007 - 2010; C.R.Bertozzi,etal,Proc.Natl.Acad.Sci.USA2002, 99, 19 - 24 ；Srivatsan,etal,Nat. Protoc. 2012, 7, 1097-1112 ；P.M.Gramlich,etal,Angew.ChemInt.Ed. 2008, 47, 8350 -8358 ；M.D.Best,etal,Biochemistry2009, 48, 6571 - 6584 ；E.Lallana,etal,Angew. Chem.Int.Ed. 2011, 50, 8794 - 8804.)。
[0006] 點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)中有一種底物是有機(jī)疊氮類化合物。傳統(tǒng)的方法都是先將疊氮 類底物合成并進(jìn)行分離純化后，與另一種含炔基的化合物進(jìn)行反應(yīng)。在傳統(tǒng)的修飾鏈接 中，生成疊氮化合物的反應(yīng)，通常是由烷基或芳香基鹵代物與疊氮化鈉進(jìn)行復(fù)分解反應(yīng) 得到，反應(yīng)需要較高的溫度或者微波加熱等劇烈條件（OrganicAzidesSynthesesand Applications，S.Br&.se，etal, 2010,AJohnWiley&Sons,Ltd,Publication)。疊氮化鈉 屬于劇毒易爆試劑，使用時(shí)給操作人員帶來了較大的安全隱患。另外，生成的疊氮類化合物 通常穩(wěn)定性不好，不能長(zhǎng)時(shí)間的進(jìn)行保存，分離純化過程都有一定的難度。一些疊氮化合物 在溶液中是穩(wěn)定存在的，但是在蒸發(fā)溶劑和濃縮的過程中，會(huì)導(dǎo)致分解，存在潛在的爆炸的 危險(xiǎn)。因此，疊氮化合物的這些特性決定了在使用它們作為點(diǎn)擊化學(xué)的底物時(shí)，在結(jié)構(gòu)多樣 性上受到了很大的限制。
[0007] 通過以上分析，可以看出化學(xué)修飾生物大分子的現(xiàn)有方法存在以下缺點(diǎn)：
[0008] (1)反應(yīng)條件苛刻，需要較高溫度或微波加熱條件。
[0009] (2)安全隱患大，使用的試劑疊氮化鈉是劇毒易爆的危險(xiǎn)試劑；有些疊氮中間體 純化過程中具有潛在的爆炸危險(xiǎn)。
[0010] (3)中間體保存條件苛刻，需避光低溫密封保存，極易變質(zhì)，從而影響鏈接反應(yīng)的 效果。
[0011] 因此，為了克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述缺陷或不足，需要對(duì)化學(xué)修飾生物大分子 的現(xiàn)有方法進(jìn)行改進(jìn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 本發(fā)明的目的在于克服上述現(xiàn)有【背景技術(shù)】的不足之處，而提供了一種新穎的基于 "一鍋法"對(duì)生物大分子進(jìn)行化學(xué)修飾的方法。
[0013] 本發(fā)明提供的式I或式II所示化學(xué)分子鏈接修飾的生物大分子的一鍋法制備方 法：
[00141
[0015] 取式A和式B所示化合物溶于溶劑中，在堿和配體存在下，使用疊氮轉(zhuǎn)移試劑和銅 催化劑，在pH值為4. 0~11. 0的緩沖溶液中，直接反應(yīng)生成式I或式II所示化合物；
[0016] 其中，R1、R2分別獨(dú)立選自生物大分子或化學(xué)小分子，兩者不同時(shí)為生物大分子或 化學(xué)小分子。
[0017] 進(jìn)一步的，所述疊氮轉(zhuǎn)移試劑選自咪唑磺酰疊氮或者三甲基硅基疊氮。
[0018] 進(jìn)一步的，所述堿為有機(jī)堿；優(yōu)選為三乙胺。
[0019] 進(jìn)一步的，所述銅催化劑為硫酸銅。
[0020] 進(jìn)一步的，所述配體為三[(1-芐基-1-氫-1，2, 3-三氮唑-4-基）甲基]胺。
[0021] 進(jìn)一步的，反應(yīng)中還需要使用還原試劑；優(yōu)選為抗壞血酸鈉。
[0022] 進(jìn)一步的，所述生物大分子是指DNA、RNA、蛋白、糖。
[0023] 進(jìn)一步的，所述DNA是指單鏈DNA或雙鏈DNA。
[0024] 進(jìn)一步的，所述單鏈DNA是指含有20~300個(gè)堿基的單鏈多聚脫氧核苷酸、雙鏈 DNA是指含有20~300個(gè)堿基對(duì)雙鏈脫氧核糖核酸。
[0025] 進(jìn)一步的，反應(yīng)溫度為4°C~90 °C;較適合的溫度為15 °C~40 °C;更適合的溫度為 20°(：、25°(：、37°(：或者40°(：;最適合的溫度為25°(：。
[0026] 進(jìn)一步的，反應(yīng)進(jìn)行時(shí)間在60分鐘到36小時(shí)范圍內(nèi)；較適合的時(shí)間段為60分鐘 到24小時(shí)內(nèi)；更適合的時(shí)間點(diǎn)為2小時(shí)、4小時(shí)、6小時(shí)、8小時(shí)、12小時(shí)，16小時(shí)；最適合的 反應(yīng)時(shí)間為12小時(shí)。
[0027] 進(jìn)一步的，反應(yīng)的試劑的加料順序?yàn)榛瘜W(xué)小分子、堿試劑、疊氮轉(zhuǎn)移試劑、銅催化 劑、配體、還原劑、生物大分子。
[0028] 進(jìn)一步的，反應(yīng)當(dāng)量為生物大分子為1當(dāng)量、化學(xué)小分子為5~1000當(dāng)量、疊氮轉(zhuǎn) 移試劑為5~1500當(dāng)量、銅催化劑為5~600當(dāng)量、配體為5~600當(dāng)量。
[0029] 進(jìn)一步的，反應(yīng)當(dāng)量為生物大分子為1當(dāng)量，還原劑為5~600當(dāng)量。
[0030] 本發(fā)明中，當(dāng)量是指摩爾當(dāng)量，例如："生物大分子為1當(dāng)量，還原劑為5~600當(dāng) 量"是指"生物大分子為1摩爾，還原劑為5~600摩爾"。
[0031] 進(jìn)一步的，所述溶劑是指常用化學(xué)溶劑，包括乙腈、甲醇、乙醇、DMF、DMS0和水。
[0032] 進(jìn)一步的，所述的制備方法包括以下步驟：
[0033]
[0034] 將式B所示化合物溶于溶劑中，加入疊氮轉(zhuǎn)移試劑、銅催化劑和有機(jī)堿，于0°C~ 100°C下反應(yīng)0. 5h~24h后，得到含有式C所示化合物的反應(yīng)液；
[0035] 或者，
[0036] 將式B所示化合物溶于溶劑中，加入疊氮轉(zhuǎn)移試劑、亞硝酸叔丁酯，于0°C~100°C 下反應(yīng)0. 5h~24h后，得到含有式C所示化合物的反應(yīng)液；
[0037]
[0038] 取步驟①所得含有式C所示化合物的反應(yīng)液，加入銅催化劑、配體、還原試劑和式 A所示化合物，于0°C~100°C下反應(yīng)0. 5h~24h后，加入三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液、 乙二胺四乙酸水溶液、醋酸鈉-醋酸緩沖液和醇溶劑，進(jìn)行分離、純化，得到式I或式II所 示化合物；
[0039] 其中，R1、R2分別獨(dú)立選自生物大分子或化學(xué)小分子，兩者不同時(shí)為生物大分子或 化學(xué)小分子。
[0040] 更進(jìn)一步的，所述的制備方法包括以下步驟：
[0041 ]
[0042] 將式B所示化合物溶于溶劑中，加入疊氮轉(zhuǎn)移試劑、銅催化劑和有機(jī)堿，于60°C下 反應(yīng)lh后，得到含有式C所示化合物的反應(yīng)液；
[0043] 或者，
[0044] 將式B所示化合物溶于溶劑中，加入疊氮轉(zhuǎn)移試劑、亞硝酸叔丁酯，于60°C下反應(yīng) lh后，得到含有式C所示化合物的反應(yīng)液；
[0045]
[0046] 取步驟①所得含有式C所示化合物的反應(yīng)液，加入銅催化劑、配體、還原試劑和式 A所示化合物，于25°C下反應(yīng)12h后，加入三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液、乙二胺四乙酸 水溶液、醋酸鈉-醋酸緩沖液和醇溶劑，進(jìn)行分離、純化，得到式I或式II所示化合物；
[0047] 其中，R1、R2分別獨(dú)立選自生物大分子或化學(xué)小分子，兩者不同時(shí)為生物大分子或 化學(xué)小分子。
[0048] 進(jìn)一步的，步驟①中，式B所示化合物為

步驟②中，式A所示化合物為
[0049] 進(jìn)一步的，式A所示化合物按照如下方法制備得到：
[0050]
[0051 ] 將4-炔基戊酸、1- (3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀 酰亞胺溶于二甲基亞砜中，加入化合物1的磷酸緩沖鹽溶液，混勻，于〇°C~100°C下反應(yīng) 0. 5h~24h后，加入三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液、醋酸鈉-醋酸緩沖液和醇溶劑，進(jìn)行 分離、純化，得到化合物2 ;
[0052] 4-炔基戊酸與1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽的摩爾比為1:1~ 1:5 ;4_炔基戊酸與N-羥基琥珀酰亞胺的摩爾比為1:1~1:5 ;4_炔基戊酸與二甲基亞砜 的摩爾體積比為1:1~1:2000ymol/yL;4_炔基戊酸與化合物1的摩爾比為1:0. 001~ 1:1 ;4_炔基戊酸與三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液的摩爾體積比為1:1~1:2000ymol/ yL;4_炔基戊酸與醋酸鈉-醋酸緩沖液的摩爾體積比為1:1~1:2000ymol/yL;4_炔基 戊酸與醇溶劑的摩爾體積比為1:1~1:2000ymol/yL。
[0053] 更進(jìn)一步的，將4-炔基戊酸、1-(3_二甲氨基丙基）-3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽和 N-羥基琥珀酰亞胺溶于二甲基亞砜中，加入化合物1的磷酸緩沖鹽溶液，混勻，于50°C下反 應(yīng)12h~24h后，加入三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液、醋酸鈉-醋酸緩沖液和醇溶劑，進(jìn) 行分離、純化，得到化合物2 ;