[0131]
[0132] 將4-氯苯胺（7. 7mg，60. 0ymol)溶于170yL乙腈，向其中加入10yL亞硝酸叔 丁酯（60.0ymol)和10yL三甲基硅基疊氮（40ymol)，在60°C反應(yīng)1小時(shí)得反應(yīng)液。
[0133] 取上述反應(yīng)液8yL(其中含有2. 5ymol的4-氯苯基疊氮），加入10. 0yL硫酸銅 水溶液（〇? 3mg，1. 89ymol)，4yL的0? 1M的三[(1-芐基氫-1，2, 3-三唑-4基）甲基]胺的 二甲亞砜溶液和10. 0yL抗壞血酸鈉水溶液（0. 4mg，2. 0ymol)和30yL炔基修飾的寡聚 脫氧核苷酸2水溶液（5.Onmol)，25°C下反應(yīng)過夜后，加入25. 0yL三羥甲基氨基甲烷-鹽 酸緩沖液（pH= 9. 0, 0. 1M)，10. 0yL的0. 1M的乙二胺四乙酸水溶液，100yL的醋酸鈉-醋 酸緩沖液（pH= 4. 7,0. 5M)和400yL的無水乙醇，放置在-20°C冷凍兩小時(shí)靜置沉降，在 4°(：下1400(^離心15分鐘沉降分離，沉淀再用85%的乙醇洗滌一次，在4°(：下1400(^離心 15分鐘沉降分離，所得寡聚脫氧核苷酸沉淀加100yL水凍干，得到目標(biāo)產(chǎn)物10。
[0134] MS(ESI)m/z885. 4 [M+9]9+，996. 1 [M+8]8+，1138. 6 [M+7]7+。
[0135] 本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了鏈接在生物大分子的化學(xué)分子上進(jìn)行由有機(jī)胺作為起始原料的點(diǎn) 擊化學(xué)反應(yīng)；與傳統(tǒng)的點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)相比，用有機(jī)胺類化合物作為原料種類豐富、廉價(jià)易 得；原位生成的疊氮中間體不需分離，彌補(bǔ)了某些胺類對應(yīng)疊氮物不易純化以及穩(wěn)定存在 時(shí)間較短而導(dǎo)致相應(yīng)點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)不能進(jìn)行的缺點(diǎn)，能得到一些在溶液中穩(wěn)定存在的疊氮 中間體，進(jìn)行下一步的點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)，大大增加了化學(xué)修飾的生物大分子結(jié)構(gòu)多樣性；本發(fā) 明采用的"一鍋法"進(jìn)行生物大分子化學(xué)修飾的中間體疊氮化物不用進(jìn)行分離純化，極大地 簡化了生物大分子化學(xué)修飾的步驟和難度，節(jié)約了人力資源。
[0136] 本方法提供的修飾生物大分子的路線簡單，條件溫和，操作方便，收率高。使用的 疊氮轉(zhuǎn)移試劑是咪唑磺酰疊氮鹽酸鹽或者三甲基硅基疊氮，它們的穩(wěn)定性好，毒性小，能夠 有效避免發(fā)生爆炸、中毒等安全事故，本發(fā)明方法的操作安全性好。
[0137] 另外，本發(fā)明"一鍋法"對生物大分子的化學(xué)修飾，為生物大分子的化學(xué)修飾提供 了新的選擇；也為高通量新藥篩選提供了強(qiáng)大的支持。例如，此方法增加了DNA結(jié)構(gòu)上化學(xué) 小分子的多樣性；本發(fā)明為ADC技術(shù)藥的鏈接技術(shù)提供了新的選擇，希望改善ADC技術(shù)藥中 鏈接物使用二硫鍵不穩(wěn)定的弊端和嚴(yán)重的副作用；本發(fā)明同時(shí)也為細(xì)胞和糖的熒光標(biāo)簽技 術(shù)提供了新的耦聯(lián)方法選擇，對追蹤帶有熒光標(biāo)記的生物分子在生命系統(tǒng)的動態(tài)過程用以 研究和診療疾病方面同樣提供了新的選擇。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 式I或式II所示化學(xué)分子鏈接修飾的生物大分子的一鍋法制備方法，其特征在于：取式A和式B所示化合物溶于溶劑中，在堿和配體存在下，使用疊氮轉(zhuǎn)移試劑和銅催化 劑，在pH值為4. 0~11. 0的緩沖溶液中，直接反應(yīng)生成式I或式II所示化合物； 其中，R1、R2分別獨(dú)立選自生物大分子或化學(xué)小分子，兩者不同時(shí)為生物大分子或化學(xué) 小分子。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于：所述疊氮轉(zhuǎn)移試劑選自咪唑磺酰疊 氮或者三甲基硅基疊氮。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于：所述堿為有機(jī)堿；優(yōu)選為三乙胺。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于：所述銅催化劑為硫酸銅。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于：所述配體為三[(1-芐 基-1-氫-1，2, 3-三氮唑-4-基）甲基]胺。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于：反應(yīng)中還需要使用還原試劑；優(yōu)選為 抗壞血酸鈉。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于：所述生物大分子是指DNA、RNA、蛋白、 糖。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于：所述DNA是指單鏈DNA或雙鏈DNA。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備方法，其特征在于：所述單鏈DNA是指含有20~300個(gè) 堿基的單鏈多聚脫氧核苷酸、雙鏈DNA是指含有20~300個(gè)堿基對雙鏈脫氧核糖核酸。10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于：反應(yīng)溫度為4°C~90°C;較適合的 溫度為15°(：~40°(：;更適合的溫度為20°(：、25°(：、37°(：或者40°(：;最適合的溫度為25°(：。11. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于：反應(yīng)進(jìn)行時(shí)間在60分鐘到36小時(shí) 范圍內(nèi)；較適合的時(shí)間段為60分鐘到24小時(shí)內(nèi)；更適合的時(shí)間點(diǎn)為2小時(shí)、4小時(shí)、6小時(shí)、 8小時(shí)、12小時(shí)，16小時(shí)；最適合的反應(yīng)時(shí)間為12小時(shí)。12. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于：反應(yīng)的試劑的加料順序?yàn)榛瘜W(xué)小分 子、堿試劑、疊氮轉(zhuǎn)移試劑、銅催化劑、配體、還原劑、生物大分子。13. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于：反應(yīng)當(dāng)量為生物大分子為1當(dāng)量、 化學(xué)小分子為5~1000當(dāng)量、疊氮轉(zhuǎn)移試劑為5~1500當(dāng)量、銅催化劑為5~600當(dāng)量、 配體為5~600當(dāng)量。14. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于：反應(yīng)當(dāng)量為生物大分子為1當(dāng)量， 還原劑為5~600當(dāng)量。15. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于：所述溶劑是指常用化學(xué)溶劑，包括 乙腈、甲醇、乙醇、DMF、DMSO和水。16. 根據(jù)權(quán)利要求1~15任意一項(xiàng)所述的制備方法，其特征在于：所述的制備方法包 括以下步驟：將式B所示化合物溶于溶劑中，加入疊氮轉(zhuǎn)移試劑、銅催化劑和有機(jī)堿，于0°C~100°C下反應(yīng)0. 5h~24h后，得到含有式C所示化合物的反應(yīng)液； 或者， 將式B所示化合物溶于溶劑中，加入疊氮轉(zhuǎn)移試劑、亞硝酸叔丁酯，于0°C~100°C下反 應(yīng)0. 5h~24h后，得到含有式C所示化合物的反應(yīng)液；取步驟①所得含有式C所示化合物的反應(yīng)液，加入銅催化劑、配體、還原試劑和式A所 示化合物，于〇°C~100°C下反應(yīng)0. 5h~24h后，加入三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液、乙 二胺四乙酸水溶液、醋酸鈉-醋酸緩沖液和醇溶劑，進(jìn)行分離、純化，得到式I或式II所示 化合物； 其中，R1、R2分別獨(dú)立選自生物大分子或化學(xué)小分子，兩者不同時(shí)為生物大分子或化學(xué) 小分子。17. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的制備方法，其特征在于：步驟①中，式B所示化合物為步驟②中，式A所示化合物，18. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的制備方法，其特征在于：式A所示化合物按照如下方法制 備得到：將4-炔基戊酸、1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀酰亞胺 溶于二甲基亞砜中，加入化合物1的磷酸緩沖鹽溶液，混勻，于〇°C~100°C下反應(yīng)0. 5h~ 24h后，加入三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液、醋酸鈉-醋酸緩沖液和醇溶劑，進(jìn)行分離、純 化，得到化合物2 ; 4_炔基戊酸與1-(3-二甲氨基丙基）-3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽的摩爾比為1:1~1:5 ; 4_炔基戊酸與N-羥基琥珀酰亞胺的摩爾比為1:1~1:5 ;4_炔基戊酸與二甲基亞砜的摩 爾體積比為1:1~1:2000ymol/yL;4_炔基戊酸與化合物1的摩爾比為1:0. 001~1:1 ; 4_炔基戊酸與三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液的摩爾體積比為1:1~l:2000iimol/iiL; 4-炔基戊酸與醋酸鈉-醋酸緩沖液的摩爾體積比為1:1~1:2000ymol/yL;4_炔基戊酸 與醇溶劑的摩爾體積比為1:1~1:2000ymol/yL〇19. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的制備方法，其特征在于：化合物1的磷酸緩沖鹽溶液的濃 度為0? 01~10ymol/yL;三輕甲基氨基甲燒-鹽酸緩沖液的濃度為0? 01~10ymol/yL; 醋酸鈉-醋酸緩沖液的濃度為〇. 01~10ymol/yL。20. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的制備方法，其特征在于：步驟①中，所述的疊氮轉(zhuǎn)移試劑為 咪唑磺酰疊氮水溶液或三甲基硅基疊氮；所述的銅催化劑為硫酸銅水溶液；所述的有機(jī)堿 為三乙胺的醇溶液；步驟②中，所述的銅催化劑為硫酸銅或硫酸銅水溶液；所述的配體為 三[(1-芐基-1-氫-1，2, 3-三氮唑-4-基）甲基]胺的二甲亞砜溶液；所述的還原試劑為 抗壞血酸鈉水溶液。21. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的制備方法，其特征在于：步驟①中，咪唑磺酰疊氮水溶液的 濃度為〇? 05~50ymol/yL;硫酸銅水溶液的濃度為0? 05~50ymol/yL;三乙胺的醇溶 液的濃度為〇? 05~50ymol/yL;步驟②中，硫酸銅水溶液的濃度為0? 05~50ymol/yL; 三[(1-芐基-1-氫-1，2, 3-三氮唑-4-基）甲基]胺的二甲亞砜溶液的濃度為0.01~ 10ymol/yL;抗壞血酸鈉水溶液的濃度為0? 05~50ymol/yL;三輕甲基氨基甲燒-鹽 酸緩沖液的濃度為〇? 01~10ymol/yL;乙二胺四乙酸水溶液的濃度為0? 01~10ymol/ yL;醋酸鈉-醋酸緩沖液的濃度為0. 01~10ymol/yL。22. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的制備方法，其特征在于：步驟①中，式B所示化合物與溶劑 的摩爾體積比為1:1~1:100000ymol/yL;式B所示化合物與咪唑磺酰疊氮的摩爾比為 1000:1~1:1 ;式B所示化合物與硫酸銅的摩爾比為2000:1~1:1 ;式B所示化合物與三乙 胺的摩爾比為1:1~1:2000 ;式B所示化合物與亞硝酸叔丁酯的摩爾比為1:1~1:2000 ; 式B所示化合物與三甲基硅基疊氮的摩爾比為2000:1~1:1 ;步驟②中，式C所示化合物 與硫酸銅的摩爾比為2000:1~1:1 ;式C所示化合物與三[(1-芐基-1-氫-1,2, 3-三氮 唑-4-基）甲基]胺的摩爾比為2000:1~1:1 ;式C所示化合物與抗壞血酸鈉的摩爾比為 2000:1~1:1 ;式C所示化合物與式A所示化合物的摩爾比為2000:1~1:1 ;式C所示化 合物與三輕甲基氨基甲燒-鹽酸緩沖液的摩爾體積比為1:1~1:100000ymol/yL;式C所 示化合物與乙二胺四乙酸水溶液的摩爾體積比為1:1~l:l〇〇〇〇〇ymol/yL;式C所示化 合物與醋酸鈉-醋酸緩沖液的摩爾體積比為1:1~1:100000ymol/yL;式C所示化合物 與醇溶劑的摩爾體積比為1:1~1:1〇〇〇〇〇ymol/yL〇
【專利摘要】本發(fā)明公開了式Ⅰ或式Ⅱ所示化學(xué)分子鏈接修飾的生物大分子的一鍋法制備方法：取式A和式B所示化合物溶于溶劑中，在堿和配體存在下，使用疊氮轉(zhuǎn)移試劑和銅催化劑，在pH值為4.0～11.0的緩沖溶液中，直接反應(yīng)生成式Ⅰ或式Ⅱ所示化合物；其中，R1、R2分別獨(dú)立選自生物大分子或化學(xué)小分子，兩者不同時(shí)為生物大分子或化學(xué)小分子。本發(fā)明提供的一種化學(xué)修飾生物大分子的新方法，工藝路線簡單，反應(yīng)條件溫和，采用咪唑磺酰疊氮鹽酸鹽或者三甲基硅基疊氮作為疊氮轉(zhuǎn)移試劑，操作安全性好，中間產(chǎn)物無需分離純化，節(jié)省了工序，降低了操作難度，可以制備得到不同化學(xué)修飾的生物大分子，非常適合產(chǎn)業(yè)上的應(yīng)用。
【IPC分類】C07H21/04, C07H1/00
【公開號】CN105111265
【申請?zhí)枴緾N201510527391
【發(fā)明人】李進(jìn), 萬金橋, 陳仰, 朱紅玉, 劉觀賽, 竇登峰
【申請人】成都先導(dǎo)藥物開發(fā)有限公司
【公開日】2015年12月2日
【申請日】2015年8月25日