[0054] 4-炔基戊酸與1-(3-二甲氨基丙基）_3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽的摩爾比為1:2 ; 4_炔基戊酸與N-羥基琥珀酰亞胺的摩爾比為1:2 ;4_炔基戊酸與二甲基亞砜的摩爾體積 比為1:40ymol/yL;4_炔基戊酸與化合物1的摩爾比為1:0. 1 ;4_炔基戊酸與三羥甲基 氨基甲烷-鹽酸緩沖液的摩爾體積比為1:50ymol/yL;4_炔基戊酸與醋酸鈉-醋酸緩沖 液的摩爾體積比為1:200ymol/yL;4_炔基戊酸與醇溶劑的摩爾體積比為1:750ymol/ yL〇
[0055] 進一步的，化合物1的磷酸緩沖鹽溶液的濃度為0.01~10ymol/yL;三羥甲 基氨基甲燒-鹽酸緩沖液的濃度為〇. 01~10ymol/yL;醋酸鈉-醋酸緩沖液的濃度為 0. 01 ~lOymol/yL。
[0056] 更進一步的，化合物1的磷酸緩沖鹽溶液的濃度為0. 5ymol/yL;三羥甲基氨基 甲燒-鹽酸緩沖液的濃度為〇? 1ymol/yL;醋酸鈉-醋酸緩沖液的濃度為0? 5ymol/yL〇
[0057] 進一步的，步驟①中，所述的疊氮轉(zhuǎn)移試劑為咪唑磺酰疊氮水溶液或三甲基硅基 疊氮；所述的銅催化劑為硫酸銅水溶液；所述的有機堿為三乙胺的醇溶液；步驟②中，所 述的銅催化劑為硫酸銅或硫酸銅水溶液；所述的配體為三[(1-芐基-1-氫-1，2, 3-三氮 唑-4-基）甲基]胺的二甲亞砜溶液；所述的還原試劑為抗壞血酸鈉水溶液。
[0058] 進一步的，步驟①中，咪唑磺酰疊氮水溶液的濃度為0. 05~50ymol/yL;硫酸銅 水溶液的濃度為〇? 05~50ymol/yL;三乙胺的醇溶液的濃度為0? 05~50ymol/yL;步 驟②中，硫酸銅水溶液的濃度為0.05~50ymol/yL;三[(1-芐基-1-氫-1，2, 3-三氮 唑-4-基）甲基]胺的二甲亞砜溶液的濃度為0. 01~10ymol/yL;抗壞血酸鈉水溶液的 濃度為〇? 05~50ymol/yL;三輕甲基氨基甲燒-鹽酸緩沖液的濃度為0? 01~10ymol/ yL;乙二胺四乙酸水溶液的濃度為0. 01~10ymol/yL;醋酸鈉-醋酸緩沖液的濃度為 0. 01 ~lOymol/yL。
[0059] 更進一步的，步驟①中，咪唑磺酰疊氮水溶液的濃度為0. 75ymol/yL;硫酸銅水 溶液的濃度為1. 5ymol/yL;三乙胺的醇溶液的濃度為0. 625ymol/yL;步驟②中，硫酸 銅水溶液的濃度為〇? 18~0? 2ymol/yL;三[(1-芐基-1-氫-1，2, 3-三氮唑-4-基）甲 基]胺的二甲亞砜溶液的濃度為〇. 01~〇. 1ymol/yL;抗壞血酸鈉水溶液的濃度為0. 1~ 0? 2ymol/yL;三輕甲基氨基甲燒-鹽酸緩沖液的濃度為0? 1ymol/yL;乙二胺四乙酸水 溶液的濃度為〇? 1ymol/yL;醋酸鈉-醋酸緩沖液的濃度為0? 5ymol/yL〇
[0060] 進一步的，步驟①中，式B所示化合物與溶劑的摩爾體積比為1:1~ 1:100000ymol/yL;式B所示化合物與咪唑磺酰疊氮的摩爾比為1000:1~1:1 ;式B所 示化合物與硫酸銅的摩爾比為2000:1~1:1 ;式B所示化合物與三乙胺的摩爾比為1:1~ 1:2000 ;式B所示化合物與亞硝酸叔丁酯的摩爾比為1:1~1:2000 ;式B所示化合物與三 甲基硅基疊氮的摩爾比為2000:1~1:1 ;步驟②中，式C所示化合物與硫酸銅的摩爾比為 2000:1~1:1 ;式C所示化合物與三[(1-芐基-1-氫-1,2, 3-三氮唑-4-基）甲基]胺的 摩爾比為2000:1~1:1 ;式C所示化合物與抗壞血酸鈉的摩爾比為2000:1~1:1 ;式C所 示化合物與式A所示化合物的摩爾比為2000:1~1:1 ;式C所示化合物與三羥甲基氨基甲 烷-鹽酸緩沖液的摩爾體積比為1:1~1:100000ymol/yL;式C所示化合物與乙二胺四 乙酸水溶液的摩爾體積比為1:1~1:100000ymol/yL;式C所示化合物與醋酸鈉-醋酸 緩沖液的摩爾體積比為1:1~1:100000ymol/yL;式C所示化合物與醇溶劑的摩爾體積 比為 1:1 ~1:100000ymol/yL〇
[0061] 更進一步的，步驟①中，式B所示化合物與溶劑的摩爾體積比為1:1~1:2ymol/ yL;式B所示化合物與咪唑磺酰疊氮的摩爾比為2:1~1:1 ;式B所示化合物與硫酸銅 的摩爾比為2:1~1:1 ;式B所示化合物與三乙胺的摩爾比為1:1~1:2 ;式B所示化合 物與亞硝酸叔丁酯的摩爾比為1:1~1:2 ;式B所示化合物與三甲基硅基疊氮的摩爾比 為2:1~1:1 ;步驟②中，式C所示化合物與硫酸銅的摩爾比為4:1~1:1 ;式C所示化合 物與三[(1-芐基-1-氫-1，2, 3-三氮唑-4-基）甲基]胺的摩爾比為120:1~5:1 ;式 C所示化合物與抗壞血酸鈉的摩爾比為3:1~1:1 ;式C所示化合物與式A所示化合物的 摩爾比為400:1~500:1 ;式C所示化合物與三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液的摩爾體 積比為1:10~1:20ymol/yL;式C所示化合物與乙二胺四乙酸水溶液的摩爾體積比為 1:2~1:10ymol/yL;式C所示化合物與醋酸鈉-醋酸緩沖液的摩爾體積比為1:40~ 1:50nmol/yL;式C所示化合物與醇溶劑的摩爾體積比為1:150~1:200nmol/yL〇
[0062] 本發(fā)明提供的一種化學修飾生物大分子的新方法，工藝路線簡單，反應(yīng)條件溫和， 采用咪唑磺酰疊氮鹽酸鹽或者三甲基硅基疊氮作為疊氮轉(zhuǎn)移試劑，操作安全性好，中間產(chǎn) 物無需分離純化，節(jié)省了工序，降低了操作難度，可以制備得到不同化學修飾的生物大分 子，非常適合產(chǎn)業(yè)上的應(yīng)用。
[0063] 本發(fā)明的優(yōu)點在于：實現(xiàn)了鏈接在生物大分子的化學分子上進行由有機胺作為起 始原料的點擊化學反應(yīng)；與傳統(tǒng)的點擊化學反應(yīng)相比，用有機胺類化合物作為原料種類豐 富、廉價易得；原位生成的疊氮中間體不需分離，彌補了某些胺類對應(yīng)疊氮物不易純化以及 穩(wěn)定存在時間較短而導致相應(yīng)點擊化學反應(yīng)不能進行的缺點，能得到一些在溶液中穩(wěn)定存 在的疊氮中間體，進行下一步的點擊化學反應(yīng)，大大增加了化學修飾的生物大分子結(jié)構(gòu)多 樣性；本發(fā)明采用的"一鍋法"進行生物大分子化學修飾的中間體疊氮化物不用進行分離純 化，極大地簡化了生物大分子化學修飾的步驟和難度，節(jié)約了人力資源。
[0064] 本方法提供的修飾生物大分子的路線簡單，條件溫和，操作方便，收率高。使用的 疊氮轉(zhuǎn)移試劑是咪唑磺酰疊氮鹽酸鹽或者三甲基硅基疊氮，它們的穩(wěn)定性好，毒性小，能夠 有效避免發(fā)生爆炸、中毒等安全事故，本發(fā)明方法的操作安全性好。
[0065] 另外，本發(fā)明"一鍋法"對生物大分子的化學修飾，為生物大分子的化學修飾提供 了新的選擇；也為高通量新藥篩選提供了強大的支持。例如，本發(fā)明方法增加了DNA結(jié)構(gòu)上 化學小分子的多樣性；本發(fā)明為ADC技術(shù)藥的鏈接技術(shù)提供了新的選擇，希望改善ADC技術(shù) 藥中鏈接物使用二硫鍵不穩(wěn)定的弊端和嚴重的副作用；本發(fā)明同時也為細胞和糖的熒光標 簽技術(shù)提供了新的耦聯(lián)方法選擇，對追蹤帶有熒光標記的生物分子在生命系統(tǒng)的動態(tài)過程 用以研究和診療疾病方面同樣提供了新的選擇。
[0066] 顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識和慣用手段，在不脫離 本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。
[0067] 以下通過實施例形式的【具體實施方式】，對本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進一步的詳細說 明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容 所實現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
【具體實施方式】
[0068] 本發(fā)明【具體實施方式】中使用的原料、設(shè)備均為已知產(chǎn)品，通過購買市售產(chǎn)品獲得。
[0069] 1、原料與試劑：
[0070] 5'端氨基修飾的寡聚脫氧核苷酸：購買自Invitrogen英杰生命科技有限公司。
[0071] 4_炔基戊酸、（吡啶_2_基）甲基胺、2_(噻吩_2_基）乙基胺、（2_苯基-惡 唑-4-基）甲基胺：購買自TCI梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司。
[0072] 2_ (4_羥基苯-1-基）乙基胺、4_溴苯胺、2_甲基苯胺、4_羥基苯胺、4_氯苯胺、二 羥甲基氨基甲烷：購買自AlfaAesar阿法埃莎中國化學有限公司。
[0073] 硫酸銅、抗壞血酸鈉、亞硝酸叔丁酯、咪唑磺酰疊氮、三甲基硅基疊氮：購買自J&K 百靈威科技有限公司。
[0074] 1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽：購買自阿達瑪斯試劑有限公司。
[0075] N-羥基琥珀酰亞胺：購買自南京愛里凱德化工有限公司。
[0076] 醋酸鈉、醋酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、鹽酸：購買自成都市科龍化工試劑廠。
[0077] 二甲基亞砜、乙醇、甲醇：購買自成都市聯(lián)合化工試劑研究所。
[0078] 2、分析條件：
[0079] HPLC:ShimadzuLC-6AD(日本島津公司）。
[0080] HPLC分離條件：反相色譜柱：Shimadzu0DS_3150*4. 6mm，5ym;流動相：A: 100mM， 三乙胺-醋酸緩沖溶液pH= 7. 0,B:乙腈；淋洗梯度：B在10分鐘內(nèi)從5%到40%，隨后 在5分鐘內(nèi)從40%到95%，最后保持95% 5分鐘；流速：1.0mL/mins;柱溫：40°C。
[0081] MS型號：ThermoLCQ-DecaXP(美國賽默飛公司）。
[0082] ESI質(zhì)譜條件：分為自動進樣器（CTC)，流動相，離子阱（LCQ)。流動相所用試劑分 為A液、B液、C液、D液，制備試劑的比例見表1。
[0083] 表1、A液、B液、C液、D液的配置比例
[0084]
[0085] HFIPA:六氟異丙醇苯胺；ACN:乙腈；DIEA:二異丙基乙胺；MeOH:甲醇；EDTA:乙二 胺四乙酸；H20 :水。
[0086] 實施例1合成炔基修飾的寡聚脫氧核苷酸
[0087]
[0088] 將5'端氨基修飾的寡聚脫氧核苷酸1 (分子量為7743.ODa，100.Onmol)溶于 20. 0yL的磷酸緩沖鹽溶液（pH= 7. 4,0. 5M)，得到寡聚脫氧核苷酸溶液。將4-炔基戊酸 (0?lmg，1. 0ymol)，1_(3_ 二甲氨基丙基）_3_ 乙基碳二亞胺鹽酸鹽（0? 38mg，2. 0ymol)和 N-羥基琥珀酰亞胺（0. 23mg，2. 0ymol)溶于40. 0yL二甲基亞砜后，加入上述寡聚脫氧核 苷酸溶液，混勻后在50°C下反應(yīng)過夜，然后依次加入50yL的0. 1M三羥甲基氨基甲烷-鹽 酸緩沖液（pH= 9. 0)、200yL的0. 5M醋酸鈉-醋酸緩沖液（pH= 4. 7)和750yL的無水 乙醇，放置在_20°C冷凍兩小時靜置沉降后，在4°C下14000g離心15分鐘沉降分離，寡聚脫 氧核苷酸沉淀再用85 %的乙醇洗滌一次，再在4°C下14000g離心15分鐘沉降分離，所得寡 聚脫氧核苷酸沉淀加100yL水凍干得目標產(chǎn)品2 :炔基修飾的寡聚脫氧核苷酸產(chǎn)物2。
[0089] HPLC:保留時間=10. 7mins;
[0090] MS(ESI)m/z868. 6 [M+9