臨床治療級細(xì)胞治療用黑色素細(xì)胞(melanocytes)規(guī)?；苽淙祟惣?xì)胞外基質(zhì)篩選培養(yǎng)方法
【專利說明】臨床治療級細(xì)胞治療用黑色素細(xì)胞（melanocytes)規(guī)?；?制備人類細(xì)胞外基質(zhì)篩選培養(yǎng)方法 一、技術(shù)領(lǐng)域：
[0001] 本發(fā)明屬于生物黑色素細(xì)胞技術(shù)，組織工程領(lǐng)域。涉及一種體外構(gòu)建高模擬體內(nèi) 貼附環(huán)境分離篩選，皮膚干細(xì)胞的培養(yǎng)、擴增技術(shù)。獲得臨床治療級皮膚黑色素細(xì)胞應(yīng)用于 組織工程皮膚構(gòu)建技術(shù)中的活性種子細(xì)胞。
[0002] 二、【背景技術(shù)】介紹：
[0003] 細(xì)胞外基質(zhì)（extracellularmatrix，ECM)廣泛存在于細(xì)胞間隙的基本填充成分， 是細(xì)胞新陳代謝、生長、繁殖、分化、表達、傳遞、互惠所依賴的及其重要場所。早期研究學(xué)者 認(rèn)為.外基質(zhì)只是一種組織內(nèi)、細(xì)胞外的單純的支持結(jié)構(gòu)。Hauschka和Konigsberg在1966 年研究發(fā)現(xiàn)填充組織間隙的膠原與促進成肌細(xì)胞轉(zhuǎn)化肌管的現(xiàn)象。并在兩年之后，得以證 明學(xué)者們才對這種穩(wěn)定外物質(zhì)微環(huán)境有了新的認(rèn)識和思考。
[0004] Hay在11年后報道了ECM對胚胎發(fā)育過程具有重要的誘導(dǎo)作用。ECM影響細(xì)胞行 為的現(xiàn)象得以關(guān)注并進行廣泛的研究但是并沒有成型的理論基礎(chǔ)佐證ECM與細(xì)胞的密切 關(guān)系。直到1982年有學(xué)者提出證明并建立ECM與細(xì)胞骨架和核基質(zhì)之間"動態(tài)互惠"的模 型。在這個模中，ECM分子與細(xì)胞表面受體互相作用，然后把信號通過細(xì)胞膜傳導(dǎo)進入細(xì)胞 漿中，引起從細(xì)胞骨架到細(xì)胞核的一系列變化，引起某些特定基因的表達。
[0005] 并證明這些基因的表達產(chǎn)物又可以反過來對ECM發(fā)生作用，今天的許多研究證實 了這個模型的合理性，并且證明細(xì)胞和ECM相互作用直接參與了細(xì)胞的黏附、生長、游走、 分化和程序性死（凋亡）的過程；外基質(zhì)參與調(diào)節(jié)細(xì)胞因子、生長因子的活性；還能夠直接 激活、啟動細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)機制。由于這種對細(xì)胞的調(diào)節(jié)和對信號的傳導(dǎo)作用。因此，我們 必須充分了解細(xì)胞外基質(zhì)的化學(xué)的、物理的、生物學(xué)性質(zhì)和功能及其在組織的形成和修復(fù) 中的作用，才能更好地應(yīng)用這些生物材料構(gòu)建成為組織接受，乃至模擬組織完善再生的"生 物構(gòu)架"。我們建立的高擬細(xì)胞外基質(zhì)材料利用的恰是反向理論，指導(dǎo)我們深入開展對ECM 的認(rèn)識，同時也反作用得到我們可利用的干細(xì)胞，這種研究模式促進學(xué)科前行及發(fā)展。
[0006] 黑色素細(xì)胞在正常皮膚組織中含量極少，黑色素細(xì)胞公認(rèn)是一種在體外具有無限 更新能力，體外培養(yǎng)具有長期生長潛能并可形成無限克隆。是色素脫失性疾病的重要參與 者，是開展病因，病理生理學(xué)研究重要細(xì)胞手段。但由于目前缺乏理想篩選方法，對臨床治 療級黑色素細(xì)胞進行篩選及鑒定方法報道較少。
[0007] 三、皮膚細(xì)胞名稱概述
[0008] 黑色素細(xì)胞（melanocyte，MC)來源于神經(jīng)嵴的樹突細(xì)胞。黑色素細(xì)胞培養(yǎng)是在皮 膚表皮細(xì)胞培養(yǎng)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。黑色素細(xì)胞培養(yǎng)研究和治療色素異常性皮膚?。ò遵?風(fēng)）及黑色素腫瘤有重要意義，為研究發(fā)病機制提供重要的條件與科研途徑。
[0009] 成人表皮層中黑色素細(xì)胞極少，基底層1560/mm2.只占表皮細(xì)胞的2%。
[0010] 體外環(huán)境下培養(yǎng)生長緩慢。增值能力極為有限，容易被角質(zhì)形成細(xì)胞以及成纖維 細(xì)胞污染，培養(yǎng)條件篩選復(fù)雜。其基本原理和方法是：用胰酶消化法使表皮和真皮分離，用 機械法從表皮的內(nèi)面獲得黑色素細(xì)胞，利用差速粘附行為以及在添加適當(dāng)成分的培養(yǎng)基中 培養(yǎng)剔除污染相關(guān)細(xì)胞達到純化培養(yǎng)過程。
[0011] 四、傳統(tǒng)篩分方法介紹
[0012] 因為皮膚細(xì)胞對基底膜有較強的粘附性，對細(xì)胞胞外基質(zhì)的粘附速度要比其它類 型細(xì)胞快得多，所以利用該種特性進行培養(yǎng)篩選。目前傳統(tǒng)的皮膚細(xì)胞篩選如下闡述：
[0013] 方法一（3T3滋養(yǎng)層法）：人類皮膚細(xì)胞體外培養(yǎng)研究己有1個世紀(jì)的歷史背景， 建立體外擴增培養(yǎng)體系于1975年由學(xué)者Rheinwald和Green所設(shè)計3TS-J2小鼠胚胎瘤的 成纖維細(xì)胞株3T3滋養(yǎng)層細(xì)胞，并用γ射線致死劑量照射，防止細(xì)胞受到異種物種的影響。 滅活3Τ3滋養(yǎng)層細(xì)胞作為培養(yǎng)細(xì)胞的滋養(yǎng)層能促。進形黑色素細(xì)胞篩選的貼附和生長，并 具有未被論證的接觸性抑制成纖維細(xì)胞生長的功能。實驗室所選用的、功能較穩(wěn)定的個亞 系但還不能完全排除對它的顧慮，還需繼續(xù)觀察和探索有效的替代方法。
[0014] 方法二（纖維蛋白原及凝血酶底物法）：GraziellaΡ學(xué)者研究用纖維蛋白原及凝 血酶作為基質(zhì)分離黑色素細(xì)胞；
[0015] 方法三（IV型膠原黏附法）：JonePH等利用上述方法從成人包皮或尸體皮經(jīng)消 化，利用IV型膠原做底物基質(zhì)分離黑色素細(xì)胞，所選用底物為異種膠原，存在不同種屬的 污染可能性，并且底物昂貴，不適合產(chǎn)業(yè)化規(guī)?；蜷L期培養(yǎng)，適合試驗性小劑量研究；
[0016] 方法四（流式細(xì)胞儀篩選法）：學(xué)者VanRossum麗j與KaurP等從人小塊活檢 組織中得到角朊細(xì)胞，利用整合素標(biāo)記異性標(biāo)志物利用流式細(xì)胞儀分離干細(xì)胞，選用方法 復(fù)雜且技術(shù)要求高，大體應(yīng)用integrini3 1，細(xì)胞黏附分子⑶49,增列細(xì)胞核抗原（PCNA)等 多種標(biāo)記進行特征分離，雖然干細(xì)胞得以篩選，但是會留有標(biāo)記物標(biāo)記滯留干細(xì)胞無法有 效去除，存在是否影響干細(xì)胞增殖、分化、變異性等。此方法適合標(biāo)記鑒定測定干細(xì)胞，并不 適合臨床應(yīng)用的干細(xì)胞富集方法；
[0017] 方法五（異種成纖維懸浮篩選法）：學(xué)者HagarB利用DMEM、低鈣離子鼠成纖維細(xì) 胞條件培養(yǎng)液作為培養(yǎng)基，不用滋養(yǎng)層細(xì)胞。但有研究報導(dǎo)黑色素細(xì)胞與基底膜脫離可誘 發(fā)進入分化周期，分化為過渡性擴充細(xì)胞，據(jù)猜想黑色素細(xì)胞與基底膜的高粘附性有可能 是維持黑色素細(xì)胞控分化特性的可能條件。所以如果不利用滋養(yǎng)層，有可能長期培養(yǎng)過程 中黑色素細(xì)胞分化引起后續(xù)研究的不可控發(fā)展；
[0018] 方法六（同體細(xì)胞貼附共生系統(tǒng)篩選法）：學(xué)者EvesPC建立了一種適合KC和MC 共培養(yǎng)系統(tǒng)-角質(zhì)形成細(xì)胞或成纖維細(xì)胞共生培養(yǎng)系統(tǒng)。學(xué)者金巖等利用參考改進學(xué)者 HagarB和Dunnwald鼠成纖維細(xì)胞，改成供體預(yù)先體外擴增的成纖維細(xì)胞為附著底物作為 滋養(yǎng)層，培養(yǎng)同體皮膚細(xì)胞，但是專利并沒有明確如何制備滋養(yǎng)層平皿的詳細(xì)步驟，鋪皿周 期短，成纖維貼壁力低，篩選反復(fù)PBS清洗純化過程會損失部分培養(yǎng)的目標(biāo)貼附成功的成 纖維細(xì)胞，從而降低目標(biāo)皮膚細(xì)胞的得率，皮膚細(xì)胞理論上具有同體同原性，另一技術(shù)問題 在于，兩種細(xì)胞在共有同一培養(yǎng)環(huán)境，的考慮培養(yǎng)液的復(fù)雜性，兩種細(xì)胞可能出現(xiàn)競爭性的 生長增殖抑制等現(xiàn)象，后續(xù)分離黑色素細(xì)胞存在技術(shù)難度，并不能優(yōu)于現(xiàn)有的六中常見方 法，建議其可把此方法改成復(fù)方加入其它覆皿效果好黏附行為比較大的其它篩選物同用增 加目標(biāo)皮膚細(xì)胞得率，或滅活成纖維鋪皿層細(xì)胞。
[0019] 取材方法：吸引水皰法、淺表皮膚活檢術(shù)獲得、包皮環(huán)切術(shù)、拉皮手術(shù)等。
[0020] 綜上所述，體外篩適宜的篩選培養(yǎng)富集所需人黑色素細(xì)胞的新技術(shù)與發(fā)展方向。 而該發(fā)明細(xì)胞生物學(xué)性能，可以做到增進功能、避免潛在有害基因及對黑色素細(xì)胞控制優(yōu) 異特性等，在基礎(chǔ)科研、臨床治療、細(xì)胞研究方向、皮膚再生損傷修復(fù)、色素脫失疾病的病理 生理學(xué)研究，高擬組織工程皮膚的構(gòu)建方面等均有歷史時期的重要不可取代的指導(dǎo)意義。
[0021] 五、組織工程皮膚背景介紹
[0022] 皮膚是人體最大的器官，參與抵御生物入侵、紫外線輻射以及防止水分丟失、調(diào)節(jié) 體溫維持個體外貌等方面起著十分重要的生理作用，其是人體免疫系統(tǒng)組成的重要的一部 分，而皮膚細(xì)胞是構(gòu)成這器官的基本單元，皮膚細(xì)胞基礎(chǔ)研究領(lǐng)域是揭示皮膚健康、發(fā)育、 預(yù)防、治療的重要科研途徑。
[0023] 再生組織工程細(xì)胞建立系工作始于本世紀(jì)（Harrison1907,Carrel1912)，指導(dǎo) 引領(lǐng)著生物學(xué)，臨床醫(yī)學(xué)材料等各大銜接領(lǐng)域，稱為重要的基礎(chǔ)科學(xué)之一。組織構(gòu)建和細(xì)胞 體外培養(yǎng)是至關(guān)重要的課題。從供體捐獻者活體取組織，模擬體內(nèi)生理環(huán)境等系列特定體 外微環(huán)境體系，進行孵化培養(yǎng)、使得組織細(xì)胞健康生長。
[0024] 組織工程皮膚建立早期應(yīng)用于修復(fù)燒傷和潰瘍以及其它皮膚損傷領(lǐng)域，麻省總醫(yī) 院的JohnF.Burke與MIT的YannasI.V.合作，制備首次人工皮膚替代物。但是這種組織 皮膚替代物并不與細(xì)胞生物學(xué)相關(guān)，隸屬于組織工程皮膚支架材料學(xué)范疇。隨著細(xì)胞生物 學(xué)的基礎(chǔ)學(xué)科發(fā)展，人們開始整合兩大學(xué)科，共同協(xié)作解決創(chuàng)傷皮膚修復(fù)構(gòu)建，真正的含活 性細(xì)胞組織工程皮膚在哈福大學(xué)HonwardGreen與MIT的EugenenBellhe合作完成。早 期定制皮膚移植救治取得了生物學(xué)醫(yī)學(xué)介矚目關(guān)注。
[0025] 20世紀(jì)80年代初期支架材料被FDA許可上市，由膠原網(wǎng)格組成的復(fù)合皮膚移植材 料被創(chuàng)造出來，內(nèi)層為牛膠原和硫酸軟骨素構(gòu)成，外層為硅膠樹脂，創(chuàng)面移植后內(nèi)層與創(chuàng)面 接觸被緩慢降解，數(shù)周后硅樹脂層移除，清創(chuàng)后覆蓋自體移植皮膚，覆蓋物被臨床所接受。
[0026] MIT的科學(xué)家Bellhe把材料學(xué)和生物學(xué)完美結(jié)合創(chuàng)造了組織工程皮膚并建立了 世界上第一家組織工程再生公司（OrganogenesisInc)，是科學(xué)界商人的典范。這家活性組 織工程皮膚先驅(qū)引領(lǐng)公司仍然是在人工皮膚市場占有率最高的組織工程公司之一。
[0027] 1997年通過美國FDA批準(zhǔn)上市的第一個組織工程產(chǎn)品由Advance