使錨狀細(xì)絲與表皮基底細(xì)胞的半橋粒分離開來，從而完整去除表皮，再用 破膜劑十二烷基磺酸鈉（〇. 2~0. 5 %SDS溶液，室溫下作用30~60min)將細(xì)胞成分從真 皮中去除。
[0103] 以上步驟可選擇性剝離表皮真皮，保留全層經(jīng)方法1進(jìn)行戊二醛交聯(lián)步驟，即可 進(jìn)行冷凍干燥脫水封裝。
[0104] 3. 1 :實(shí)例方法3【具體實(shí)施方式】：
[0105]
[0106] 實(shí)例方法4 :用0. 25~0. 40 %胰蛋白酶和0. 02~0. 04%EDTA(1 : 2)混合液聯(lián) 合消化組織塊，37°C，快速消化10~60min，反復(fù)漂洗脫細(xì)胞，最后放入交聯(lián)液中交聯(lián)4~ 6h，結(jié)束后用超純水（或注射用水）反復(fù)沖洗8~10次去除殘留戊二醛，即可進(jìn)行冷凍干 燥脫水封裝。
[0107] 4. 1 :實(shí)例方法4【具體實(shí)施方式】：
[0108]
[0109] 以上方法均可組合制備出如上述[1. 1]、[1. 2]、[1. 3]種類中所述的高擬體內(nèi)細(xì) 胞外基質(zhì)，進(jìn)行皮膚細(xì)胞篩選。
[0110] 上述方法制得略有差異，時間上成本上有異、但均可有效使得細(xì)胞成分被清除，基 質(zhì)的結(jié)構(gòu)完整性被保留，含有彈力素、硫酸角質(zhì)素、層粘素、IV型膠原、纖維連接素、結(jié)合素、HLA-DR的含量較多，基底膜結(jié)構(gòu)成分均可以完整保留。
[0111] 對于附著性的種子皮膚細(xì)胞提供了有利微環(huán)境，使其表達(dá)、生長、增殖、分化等起 到及其重要，并且優(yōu)于以上提及的幾種常規(guī)篩選方法不可替代高模擬附著狀態(tài)空間。我們 稱之為"細(xì)胞種植黑土壤環(huán)境"。
[0112] 高擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)篩選皮膚細(xì)胞黑色素細(xì)胞培養(yǎng)法
[0113] 五、皮膚取材篩選：
[0114] 皮膚細(xì)胞篩選部位包括，胎兒皮膚、包皮外板、頭皮、腋窩部位皮膚。
[0115] 高擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)部位取材：胎兒皮膚、包皮外板、頭皮、腋窩部位皮膚、其他部 位皮膚均可。
[0116] 領(lǐng)用時以含有抗生素（青霉素80~100u/ml和80~100μg/ml鏈霉素）的PBS 充分浸泡3~5min，修整標(biāo)本盡量去除皮下組織。
[0117] 六、皮膚細(xì)胞篩選培養(yǎng)步驟
[0118] 因?yàn)楹谏丶?xì)胞對基底膜有較強(qiáng)的粘附性，對細(xì)胞胞外基質(zhì)的粘附速度要比角質(zhì) 形成細(xì)胞快，兩者都是表皮層細(xì)胞存在差速貼壁粘附生長行為，利用差速去除角質(zhì)形成細(xì) 胞，所以針對該種特性進(jìn)行培養(yǎng)篩選。
[0119] 七、黑色素細(xì)胞篩選培養(yǎng)權(quán)利要求方法：
[0120] 1、培養(yǎng)液制備：
[0121] 配制培養(yǎng)液A:配制培養(yǎng)液A:滅活胎牛血清40~60ml、轉(zhuǎn)鐵蛋白5~15μg/ml、 維生素Β40· 5~1X10 4/L、維生素Cl~3μg/ml、胰島素2~4μg/ml、青霉素50-100u/ml、 霍亂霉素2. 5~4. 5u/L、EGF5~25ng/ml、十四烷酰佛波醇-13-乙酯（TPA)O. 1~0. 3μg/ ml、G41880~100μg/ml、鏈霉素50~100μg/ml氫化可的松0· 4μg/ml、商用培養(yǎng)基DMEM/ F12 (3 : 1)定容到 500ml。PH控制在 7.2 ~7.4。
[0122] A. 1 :配制培養(yǎng)液A【具體實(shí)施方式】
[0123]
[0124] 配制培養(yǎng)液B:滅活胎牛血清80ml、轉(zhuǎn)鐵蛋白6~17yg/ml、維生素B40.5~ 1X10 4/L、維生素D21~3μg/ml、維生素C1~3μg/ml、胰島素2~3μg/ml、節(jié)絲霉素 B0. 2~(λ6μg/ml、霍亂霉素2. 5~4. 5u/L、EGF5~25ng/ml、牛腦垂體提取物（ΒΡΕ) 1~ 3mg/L、氫化可的松0. 3μg/ml、鏈霉素50~100μg/ml、十四烷酰佛波醇-13-乙酯 (TPA) 0· 1 ~0· 3μg/ml、內(nèi)皮素-115 ~30μg/ml、bFGF5 ~15ng/ml、G41880 ~100μg/ml、 腺苷10~25mg/ml、商用培養(yǎng)基DMEM與商用培養(yǎng)基F12(l: 1)定容到500ml。PH控制在 7. 2 ~7. 4。
[0125] B. 1 :配制培養(yǎng)液B【具體實(shí)施方式】
[0126]
[0127]
[0128] 配制培養(yǎng)液C:滅活胎牛血清60ml、轉(zhuǎn)鐵蛋白6~17yg/ml、維生素B40.5~ 1X10 4/L、維生素D21~3μg/ml、維生素C1~3μg/ml、胰島素2~3μg/ml、節(jié)絲霉素 B0. 2~0· 5μg/ml、霍亂霉素2. 5~4. 5u/L、EGF5~25ng/ml、牛腦垂體提取物（ΒΡΕ) 1. 5~ 3mg/L、鏈霉素50~80μg/ml、氫化可的松0. 3μg/ml、十四烷酰佛波醇-13-乙酯 (TPA) 0· 1 ~0· 3μg/ml、內(nèi)皮素-115 ~30μg/ml、bFGF5 ~15ng/ml、G41860 ~80μg/ml、 腺苷10~25mg/ml、商用培養(yǎng)基DMEM與商用培養(yǎng)基F12(l: 1)定容到500ml。PH控制在 7. 2 ~7. 4。
[0129] C. 1 :配制培養(yǎng)液C【具體實(shí)施方式】
[0130]
[0131] 說明此配方為原代培養(yǎng)，建系穩(wěn)定后繼續(xù)傳代減少胎牛血清使用量，培養(yǎng)馴化細(xì) 胞無血清培養(yǎng)習(xí)性。其他如G418、TPA、胰島素、氫化可、抗生素的松相應(yīng)進(jìn)行遞減性馴化培 養(yǎng)。其他基礎(chǔ)配方不變。
[0132] 2、消化液配制法：
[0133] 消化液配制A:含溶質(zhì)中性蛋白酶0. 1%無Ca2+、Mg2+、無血清培養(yǎng)液為溶劑，配制溶 液。
[0134] 消化液配制8:含溶質(zhì)0.25%胰酶和0.02^^0了4(1:1)無0& 2+、1%2+、無血清培 養(yǎng)液為溶劑，配制溶液。
[0135] 消化液配制（：：含溶質(zhì)0.25%胰酶和0.01^^0了4(1:1)無0& 2+、1%2+、無血清培 養(yǎng)液為溶劑，配制溶液。
[0136] 3、皮膚凍融保存液制備：
[0137] 抗凍溶質(zhì)組分包括：維生素Μ5~15μg/ml，維生素C2~6μg/ml，硫酸軟骨 素3~6%，聚乙二醇4ml、滅活小牛血清10~15%、甘油20%、甘露醇3ml、細(xì)胞松弛素 2. 7yg/ml、二甲基亞砜（DMS0)10%、保存液以DMEM/F12(1 : 1)46~50%為溶劑制備抗凍 溶液。PH控制在7. 3~7. 4,0. 22μm微孔濾過除菌。
[0138] 3. 1 :3皮膚及篩選細(xì)胞凍融保存液制備【具體實(shí)施方式】：
[0139]
[0140] 說明，其特征在于：該冷凍液不僅可以通過冷凍長期保存皮膚細(xì)胞活性、配方設(shè)計 還可以具有抑制朗格漢斯細(xì)胞呈遞功能而起到可降低皮膚的免疫原性。
[0141] 4、皮膚標(biāo)本照射低溫儲存免疫逃逸抗原性細(xì)胞方法：
[0142] 3. 1免疫逃逸方法射線法：表皮標(biāo)本處理：取五所述的皮膚，浸泡在培養(yǎng)液A中經(jīng) 紫外線B/C(UVB中紫外線，UVC遠(yuǎn)紫外線）照射10~30min。
[0143] 說明：紫外線照射、γ射線會降低免疫排斥反應(yīng)，紫外線照射能夠有效減少朗科 漢斯細(xì)胞數(shù)量、顯著抑制朗格漢斯細(xì)胞的抗原呈遞能力。
[0144] 目前并未揭示照射如何影響APC功能，射線可影響表皮細(xì)胞產(chǎn)生如IL-10、角質(zhì)層 中的尿苷酸（順式咪唑丙烯酸）等一些免疫抑制物以此降低移植所產(chǎn)生的免疫排斥效應(yīng)。 臨床治療經(jīng)照射后的皮膚移植存活時間顯著延長已經(jīng)被廣泛學(xué)者醫(yī)生認(rèn)可。
[0145] 紫外線是一種外源性的促細(xì)胞分裂劑。表皮存在一個復(fù)雜的旁分泌和自分泌網(wǎng)絡(luò) 調(diào)節(jié)著人類黑色素細(xì)胞的生存、增殖和功能，這個網(wǎng)絡(luò)通過紫外線作用而上調(diào)。受紫外線上 調(diào)的因子包括d-MSH、ET-1、GM-CSF、SCF、bFGF、一氧化氮（Ν0)和組織胺等因子。黑色素細(xì) 胞培養(yǎng)周期利用中波紫外線UVB照射10~30min能夠刺激黑色素細(xì)胞的增殖、移行及黑素 合成。
[0146] 3. 2免疫逃逸方法凍融法：
[0147] 表皮標(biāo)本處理：取五所述的皮膚，浸泡皮膚凍融保存液經(jīng)抗凍液處理，分別放置 在-40、-60、-90、-100、-196°C環(huán)境中 12 ~48h。
[0148] 說明：經(jīng)低溫保存后朗格漢斯細(xì)胞細(xì)胞膜HLA-DR表達(dá)變化不明顯，但其共刺激分 子CD86卻顯著減少了，移植這樣的皮膚，被受體接受時間明顯延長。同時低溫使朗格漢斯 細(xì)胞的功能受限、胞突消失、數(shù)量減少、體積變小、經(jīng)試驗(yàn)小鼠移植試驗(yàn)表明這些溫度點(diǎn)都 可以明顯降低移植排斥現(xiàn)象，趨勢呈現(xiàn)溫度越低免疫逃逸現(xiàn)象越明顯。
[0149] 5、黑色素細(xì)胞篩選步驟方法：
[0150] 步驟1、取0. 5X1.0cm、lX2cm大小或其它規(guī)格的皮膚組織標(biāo)本，以含抗生素的 PBS沖洗3~6次，置消化液配制A中4°C冷消化12~18h取出標(biāo)本，剝離表皮、真皮層；收 集表皮皮片，置消化液配制B或C中。37°C10~30min消化，用配制培養(yǎng)液A終止消化，稍 加吹打后，過濾，收集細(xì)胞混懸液。600~1000r/min離心5~lOmin，棄取上清液，加入配 制培養(yǎng)液A養(yǎng)液，細(xì)胞計數(shù)，重懸細(xì)胞，細(xì)胞濃度調(diào)整至1X103~1X10 5/ml。
[0151] 步驟2、取高擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)選所述的[1.2]、也可選高擬體內(nèi)細(xì)