ion，purificationand cultivationofconjunctivalmelanocytes[J].ExpEyeRes，007,84(4) :655-66.
[0057] [27]YamaguchiY，HearingVJ.Physiologicalfactorsthatregulateskin pigmentation[J] ·Biofactors，009, 35() :193-199.
[0058] [28]HirobeT，ShinpoT?HiguchiK，etal.Lifecycleofhumanmelanocytes isregulatedbyendothelin-1andstemcellfactorinsynergywithcyclicAMP andbasicfibroblastgrowthfactor[J] ·JDermatolSci，010，（57) :130_13L
[0059] [29]朱寧文：中華人民共和國科學(xué)技術(shù)部國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃《細(xì)胞治療制 品臨床級皮膚細(xì)胞生物反應(yīng)器規(guī)模化無血清制備及高效生物載體細(xì)胞移植關(guān)鍵技術(shù)研究》 (863計劃）課題實施方案書[M]，2014-2016.
[0060] [30]朱寧文：生物反應(yīng)器組織工程活性人工皮膚產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)含有活化素A的無血 清培養(yǎng)液及其配制方法授權(quán)專利。
[0061] 本發(fā)明的具有以下優(yōu)點：
[0062] 本發(fā)明公開了黑色素細(xì)胞的培養(yǎng)、篩選、擴(kuò)增技術(shù)，獲得臨床級應(yīng)用細(xì)胞這些瓶頸 一直是生物學(xué)細(xì)胞領(lǐng)域研究熱點和難點，目前利用基底膜顯著黏附特性進(jìn)行分離純化，采 用三維維培養(yǎng)擴(kuò)增手段獲得。
[0063] 該發(fā)明適合依賴擴(kuò)增貼壁型細(xì)胞并提供三維高擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)系統(tǒng)進(jìn)行目標(biāo) 細(xì)胞水平的篩選與分離。
[0064] 本發(fā)明屬于高模擬體內(nèi)貼附環(huán)境，體外培養(yǎng)成體（胚胎成體皮膚）黑色素細(xì)胞的 生物細(xì)胞新型培養(yǎng)技術(shù)。其特征在于：細(xì)胞基質(zhì)底物為供體脫細(xì)胞表皮，真皮為基質(zhì)底物篩 選最佳黏附場所篩選黑色素細(xì)胞的制備方法；相應(yīng)表皮真皮細(xì)胞高模擬底物所在環(huán)境黏附 篩選培養(yǎng)目標(biāo)黑色素細(xì)胞。用該方法取得的黑色素細(xì)胞，具有高傳代能力，高增殖能力，此 方法比傳統(tǒng)意義上的黑色素細(xì)胞篩選更具科研與教學(xué)臨床應(yīng)用及深入研究黑色素細(xì)胞生 長增殖瘤變提供不可估量的科研學(xué)術(shù)價值，開創(chuàng)體外高擬體內(nèi)貼壁附著培養(yǎng)的新紀(jì)元，此 方法提出為國內(nèi)國際首創(chuàng)。
[0065] 通過這種高目標(biāo)模式的篩選，結(jié)合組織工程免疫原性細(xì)胞如何安全獲得免疫逃 逸，延長移植時間增加組織工程臨床應(yīng)用，獲得臨床級黑色素細(xì)胞促進(jìn)治療色素異常性皮 膚病（白癜風(fēng)）有重要意義提供了絕對優(yōu)勢的解決方案。
[0066] 1、組織工程皮膚；同體-高擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)，基質(zhì)附著體外篩選方法對種子干 細(xì)胞進(jìn)行篩選與于體內(nèi)的微環(huán)境一致性是目前任何方法不可取代的，并且制備簡單可反復(fù) 使用；是構(gòu)建世界首例含黑色素細(xì)胞組織工程全層皮膚基礎(chǔ)；
[0067]2、特異性強(qiáng)，通過免疫組化檢測、透射電鏡觀察及流式細(xì)胞儀檢測，結(jié)果表明本發(fā) 明的黑色素細(xì)胞純度高；
[0068] 3、創(chuàng)傷修復(fù)中的應(yīng)用、在基因研究方面、美容整形修復(fù)，口腔疾病、皮膚病領(lǐng)域；
[0069] 4、黑色素細(xì)胞科研價值：皮膚黑色素細(xì)胞細(xì)胞譜系的研究，深入探討研究黑色素 細(xì)胞黏附，生長、增殖、分化、免疫表達(dá)等學(xué)科基礎(chǔ)研究；
[0070]5、該方法可為其它器官體外培養(yǎng)再生提供良好的科研理論基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0071] -、高擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)種類
[0072] [1. 1]其特征在于：針對本發(fā)明技術(shù)的發(fā)展現(xiàn)狀，本發(fā)明的目的是提供一種高擬 體內(nèi)表皮層做為細(xì)胞外基質(zhì)為篩選貼附，成體或胚胎皮膚黑色素細(xì)胞篩選分離和體外培養(yǎng) 的方法，并使獲得的高純度黑色素細(xì)胞。
[0073] [1.2]其特征在于：針對本發(fā)明技術(shù)的發(fā)展現(xiàn)狀，本發(fā)明的目的是提供一種高擬 體內(nèi)真皮層作為細(xì)胞外基質(zhì)為篩選貼附，成體或胚胎皮膚黑色素細(xì)胞篩選分離和體外培養(yǎng) 的方法，并使獲得的高純度黑色素細(xì)胞。
[0074] [1.3]其特征在于：針對本發(fā)明技術(shù)的發(fā)展現(xiàn)狀，本發(fā)明的目的是提供一種高擬 體內(nèi)全層皮膚作為為細(xì)胞外基質(zhì)為篩選貼附，成體或胚胎皮膚皮膚細(xì)胞篩選分離和體外培 養(yǎng)的方法，并使獲得的高純度皮膚細(xì)胞。皮膚細(xì)胞包括：（黑色素細(xì)胞、毛囊干細(xì)胞、真皮多 能干細(xì)胞、及其它皮膚附件附屬相關(guān)的干細(xì)胞及皮膚細(xì)胞）。
[0075] 這種篩選分離和體外培養(yǎng)的方法，獲得的黑色素細(xì)胞克服以上傳統(tǒng)方法的缺陷。
[0076] 發(fā)明屬生物成體（胎兒）皮膚細(xì)胞細(xì)胞技術(shù)領(lǐng)域，涉及表皮層黑色素細(xì)胞的分離 與培養(yǎng)方法。方法特征包括：同體表皮脫細(xì)胞表皮底物預(yù)備；同體表皮細(xì)胞的分離；利用高 擬體內(nèi)附著基質(zhì)皮膚細(xì)胞的篩選及培養(yǎng)。目前用該法在體外已穩(wěn)定培養(yǎng)傳代超過16 (代）， 經(jīng)體內(nèi)外實驗證實該細(xì)胞無細(xì)胞毒，具有強(qiáng)的增殖能力。黑色素細(xì)胞該方法研究在科研、教 學(xué)及臨床的應(yīng)用起到不可估量的作用，同時孕育著巨大學(xué)術(shù)方向與社會效益和經(jīng)濟(jì)效益。
[0077] 二、高擬擬體內(nèi)細(xì)胞基質(zhì)構(gòu)成：
[0078] 經(jīng)分析含有多種膠原并包含IV型、其中I型膠原含量最大（I與III型膠原的比 例為10 : 1)，同時還保留了完整的基底膜結(jié)構(gòu)。
[0079] 三、高擬體內(nèi)細(xì)胞基質(zhì)底物孔隙率與黏附表面特征：
[0080] 高擬底物電鏡觀察，測定表皮黏附的底物組織再生的基底膜孔隙直徑為32~ 145μm，促進(jìn)黏附真皮組織再生底物基底膜多孔孔隙直徑為72~191μm。這種孔隙率所購 建的空間黏附表面均有有利干細(xì)胞黏附附著生長、增殖、分化。
[0081] 通過以上制備方法；有效的保留了皮膚細(xì)胞外基質(zhì)的微觀構(gòu)架和完整的基底膜結(jié) 構(gòu)，其主要成分包括各型膠原、彈性蛋白、蛋白多糖及糖胺多糖等不溶性基質(zhì)成分，可為黑 色素細(xì)胞快速粘附、增殖擴(kuò)展提供有力的支持。因此，高擬底物是目前最理想的組織工程皮 膚干細(xì)胞及皮膚細(xì)胞篩選的解決方案。
[0082] 四、皮膚細(xì)胞高擬擬體內(nèi)細(xì)胞基質(zhì)制備具體實施步驟與方法：
[0083] 一、包括以下兩個步驟與方法：
[0084] 步驟一：皮膚消毒處理過程：取供體皮膚包括以下（胚胎皮膚、成體包皮外板、頭 皮、腋下皮膚、及軀干皮膚均可）含表皮真皮結(jié)構(gòu)的斷層皮膚，剪切成組織塊浸泡在生理鹽 水稀釋含〇. 05~0. 1 %苯扎溴銨溶液中10~15min，消毒處理，用無菌生理鹽水反復(fù)沖洗 殘余苯扎溴銨。
[0085] 步驟二：低溫-60~-80°C冷凍干燥，真空度達(dá)到20~llOpa，脫去組織塊90~ 95%以上水分，取出密封與真空包裝，經(jīng)輻照25~60KGY劑量滅菌。終品可以在室溫中保 存長達(dá)5年。啟動只需浸泡37°C，PBS液或下面所述營養(yǎng)液復(fù)蘇15~30min即可應(yīng)用，浸 泡延長至10~12h效果更佳。使用后并且應(yīng)用去細(xì)胞漂洗液（見下方法中相應(yīng)提及適合 的脫細(xì)胞液）脫細(xì)胞處理、再經(jīng)過上述過程永生反復(fù)使用的特點。
[0086] 1 :步驟二【具體實施方式】：
[0087]
[0088] 上述所提及的脫細(xì)胞液制備如下所述：
[0089] 二、方法：
[0090] 實例方法1 :皮片經(jīng)處理后加入0. 1~0. 25%蛋白酶冰浴冷消12~48h。用含 0. 25%戊二醛磷酸緩沖溶液調(diào)節(jié)PH在7. 20~7. 40之間用交聯(lián)液沖洗組織塊3~6次，最 后放入交聯(lián)液中交聯(lián)4~6h，結(jié)束后用超純水（或注射用水）反復(fù)沖洗8~10次去除殘留 戊二醛，即可進(jìn)行冷凍干燥脫水封裝。
[0091]1. 1:實例方法1【具體實施方式】：
[0092]
[0094] 方法一特點：交聯(lián)劑可有效的是結(jié)締組織蛋白不可容性交聯(lián)構(gòu)架，增強(qiáng)底物的抗 降解性，保持底物完整，蛋白酶處理底物可使其柔任性增強(qiáng)。
[0095] 皮膚表皮層內(nèi)含四層結(jié)構(gòu)，各層細(xì)胞量為10~30%，其中生發(fā)層稱為基底細(xì)胞層 是細(xì)胞最為活躍的附著分裂分化場所，有達(dá)9~15層之多；顆粒層結(jié)構(gòu)含有大量間隙層狀 物，角化層多呈網(wǎng)狀編織狀，立體復(fù)雜的空間互穿行結(jié)構(gòu)，體外支架材料很難模擬模仿。故 此類底物基質(zhì)是最適合細(xì)胞粘附增殖生長分化所需的理想微環(huán)境場所。
[0096] 實例方法2 :酶-非離子表面活性劑-絡(luò)合劑聯(lián)合法
[0097] 0. 1~0. 25%DisPase中性蛋白酶與0. 01~0. 02%EDTA聯(lián)合消化，中性蛋白酶作 用于基底膜，選擇性地分解纖維連接素與IV型膠原（4°C下作用48h)，然后應(yīng)用非離子型表 面活性劑使細(xì)胞溶解破壞！^切1^-100(聚乙二醇辛基苯基醚）（0.3~0.6%溶液，室溫下 作用24~48h)與生物膜中的磷脂等脂質(zhì)結(jié)合形成復(fù)合物溶解于溶液中，同時TritonX-100 中的親油基端也能和細(xì)胞外膜蛋白結(jié)合破壞生物膜，從而達(dá)到脫棄細(xì)胞作用。
[0098] 消化后可選擇性剝離表皮真皮，經(jīng)方法1進(jìn)行戊二醛交聯(lián)步驟，即可進(jìn)行冷凍干 燥脫水封裝。
[0099] 2. 1 :實例方法2【具體實施方式】：
[0100]
[0101] 實例方法3 :絡(luò)合劑加鹽-陰離子表面活性劑法
[0102] 利用高滲氯化鈉溶液（0. 01~0. 02%EDTA含0. 6~0. 8mol/L氯化鈉溶液，37°C 下作用12~24h)