胞外基質(zhì)選所 述的[1. 1]、高擬體內(nèi)細胞外基質(zhì)選所述的[1. 3]，用含抗生素的PBS沖洗3次，再用配制培 養(yǎng)液A沖洗3次，于37°C，浸泡在培養(yǎng)液A中復蘇10~12h備用。
[0152] 步驟3、黑色素細胞的篩選及培養(yǎng)：取預備好的高擬體內(nèi)細胞外基質(zhì)選所述的 [1. 2]放入平皿加入配制培養(yǎng)液B，加入細胞濃度1X103~1X10 5/ml表皮細胞懸液，37°C， 氣相5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)2~4h取出，鏡檢星狀黑色素細胞、樹突狀分枝伸展，并有少量多 角形角質(zhì)形成細胞貼壁，伸出觸角，取出轉移高擬體內(nèi)細胞外基質(zhì)選所述的[1.2]，PBS或 培養(yǎng)液B清洗3~6次，目標黑色素細胞貼壁粘附于高擬體內(nèi)細胞外基質(zhì)選所述的[1. 2] 上。換皿加入配制培養(yǎng)液C培養(yǎng)，后每2~3d換液一次繼續(xù)擴增培養(yǎng)。
[0153] 步驟4、消化富集傳代培養(yǎng)：
[0154] 上述黑色素細胞經(jīng)擴增后，加入消化液配制B或C消化高擬體內(nèi)細胞外基質(zhì)選所 述的[1. 2]，37°C消化4~8min，培養(yǎng)液B終止消化；稍加吹打，過濾收集細胞懸液轉移到離 心管，600~1000r/min離心4~6min，棄上清液，加入配制的培養(yǎng)液C，重懸細胞，以1~ 3X106/ml的密度轉移含滋養(yǎng)層的皿中培養(yǎng)，置37°C、氣相5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每2~3d換 配制培養(yǎng)液C一次繼續(xù)擴增培養(yǎng)。
[0155] 說明：在培養(yǎng)過程中周期利用中波紫外線UVB照射10~30min能夠刺激黑色素細 胞的增殖、移行及黑素合成。在提升目標細胞純度，可重復進行黑色素細胞具體實施方法3 步驟獲得更高純度的黑色素細胞。同時也可以選取高擬體內(nèi)細胞外基質(zhì)選所述的[1. 1]、高 擬體內(nèi)細胞外基質(zhì)選所述的[1.3]高擬體內(nèi)細胞外基質(zhì)，進行篩選。
[0156] 6、黑色素細胞生物學特性及免疫組織化學法檢：
[0157] 該發(fā)明方法獲得的黑色素細胞
[0158] 形態(tài)學鑒別：顯微鏡下黑色素細胞均呈星狀、樹突狀分枝。
[0159] 1^〇?&染色，將傳代純化黑色素細胞經(jīng)含0.28/正0了4.似 2的0.25%胰蛋白酶消 化后接種蓋玻片6孔培養(yǎng)板內(nèi)，細胞貼壁穩(wěn)定后棄去培養(yǎng)液，用預熱的D-Hank's液洗滌3 次。2. 5g/l戊二醛固定，加入含有l(wèi)gPL培養(yǎng)液，37°C孵教育4h，期間換液1次，風干后甘油 封片，鏡下爬片黑色素細胞質(zhì)及樹突分枝呈黑色，染色結果均陽性。
[0160] 抗S-100免疫組化染色顯示黑色素細胞質(zhì)及樹突分枝呈棕黃色陽性著色，抗 HMB-45免疫組化染色黑色素細胞質(zhì)及樹突分枝無著色，均為陰性。
[0161 ] 培養(yǎng)細胞純度大于> 96 % ;
[0162] 流式細胞儀黑色素細胞周期考察：分析DNA合成前期G1期由第6代占53. 6增加 到16代的72. 7% ;DNA合成期S期由第6代的32. 4%減少到19. 0% ;DNA合成后期G2期 由第6代占的17. 6%減少到5. 5%。
【附圖說明】
[0163] 圖1是本發(fā)明皮膚細胞高擬體內(nèi)細胞外基質(zhì)的制備流程。
[0164] 圖2是本發(fā)明的臨床治療級細胞治療用黑色素細胞高擬體內(nèi)細胞篩選培養(yǎng)方法 流程。
【主權項】
1. 一種用于篩選和培養(yǎng)臨床治療級細胞治療用黑色素細胞（melanocytes)規(guī)模化制 備的培養(yǎng)基組合，其特征在于，其包括； 培養(yǎng)液A :滅活胎牛血清40~60ml、轉鐵蛋白5~15 y g/ml、維生素M 0. 5~I X 10 V L、維生素Cl~3 y g/ml、胰島素2~4 y g/ml、青霉素50-100u/ml、霍亂霉素2. 5~4. 5u/ L、EGF5 ~25ng/ml、十四烷酰佛波醇-13-乙酯（TPA)O. 1 ~0? 3μg/ml、G418 80 ~IOOyg/ ml、鏈霉素50~lOOμg/ml氫化可的松0. 4μg/ml、商用培養(yǎng)基DMEM/F12(3 : 1)定容到 500ml ； 培養(yǎng)液B :滅活胎牛血清80ml、轉鐵蛋白6~17 y g/ml、維生素MO. 5~I X 10 4/L、維生 素D2 1~3 y g/ml、維生素Cl~3 y g/ml、胰島素2~3 y g/ml、節(jié)絲霉素B0. 2~0? 6 y g/ ml、霍亂霉素2. 5~4. 5u/L、EGF5~25ng/ml、牛腦垂體提取物（BPE) 1~3mg/L、氫化可的 松0? 3 y g/ml、鏈霉素50~100 y g/ml、十四烷酰佛波醇-13-乙酯（TPA) 0? 1~0? 3 y g/ml、 內(nèi)皮素 _115 ~30 y g/ml、bFGF5 ~15ng/ml、G41880 ~100 y g/ml、腺昔 10 ~25mg/ml、商 用培養(yǎng)基DMEM與商用培養(yǎng)基F12 (I : 1)定容到500ml ; 配制培養(yǎng)液C :滅活胎牛血清60ml、轉鐵蛋白6~17 y g/ml、維生素MO. 5~IX 10 V 1、維生素02 1~31^/1111、維生素(：1~31^/1111、胰島素2~31^/1111、節(jié)絲霉素80.2~ 0? 5 y g/ml、霍亂霉素2. 5~4. 5u/L、EGF5~25ng/ml、牛腦垂體提取物（BPE) L 5~3mg/ L、鏈霉素50~80 y g/ml、氫化可的松0. 3 y g/ml、十四燒酰佛波醇-13-乙酯（TPA)O. 1~ 〇? 3 y g/ml、內(nèi)皮素-115 ~30 y g/ml、bFGF5 ~15ng/ml、G41860 ~80 y g/ml、腺昔 10 ~ 25mg/ml、商用培養(yǎng)基DMEM與商用培養(yǎng)基F12(l : 1)定容到500ml;2. -種制備高擬體內(nèi)細胞外基質(zhì)的方法，其特征在于，其包括步驟： a)取材及皮膚消毒處理；b)脫細胞處理；優(yōu)選地，還進一步包括將消毒或經(jīng)脫細胞處 理的皮膚進一步進行低溫、脫水、輻照滅菌處理； 所述步驟b)的脫細胞方法選自冷酶交聯(lián)劑法、酶-非離子表面活性劑-絡合劑聯(lián)合 法、絡合劑加鹽-陰離子表面活性劑法或胰酶聯(lián)合H)TA交聯(lián)液法。3. 權利要求2所述方法，其特征在于，其中冷酶交聯(lián)劑法是：加入0. 1~0. 25%蛋白酶 冰浴冷消12~48h。用含0. 25%戊二醛磷酸緩沖溶液，PH在7. 20~7. 40之間，交聯(lián)4~ 6h，超純水或注射用水沖洗8~10次。4. 權利要求2所述方法，其特征在于，其中酶-非離子表面活性劑-絡合劑聯(lián)合法是： 0? 1 ~0? 25% 中性蛋白酶與 0? 01 ~0? 02% EDTA，TritonX-100(0. 3 ~0? 6% )溶液，室溫 下作用24~48h。5. 權利要求2所述方法，其特征在于，其中絡合劑加鹽-陰離子表面活性劑法是： 0? 01~0? 02% EDTA含0? 6~0? 8mol/L氯化鈉溶液，37°C下作用12~24h，后用（0? 2~ 0. 5% SDS溶液，室溫下作用30~60min)。6. 權利要求2所述方法，其特征在于，其中胰酶聯(lián)合EDTA交聯(lián)液是：0. 25~0. 40 %胰 蛋白酶和0. 02~0. 04%EDTA(1 : 2)，37°C快速消化10~60min。交聯(lián)液中交聯(lián)4~6h。 交聯(lián)后用超純水或注射用水沖洗8~10次。7. 由權利要求2-6所述任一方法制備的高擬體內(nèi)細胞外基質(zhì)。8. 權利要求2-6所述任一方法制備的高擬體內(nèi)細胞外基質(zhì)或者權利要求7所述的高擬 體內(nèi)細胞外基質(zhì)在篩選臨床治療級細胞治療用黑色素細胞中的用途。9. 一種利用權利要求1所述的培養(yǎng)基組合和權利要求7所述的高擬體內(nèi)細胞外基質(zhì)篩 選和培養(yǎng)臨床治療級細胞治療用黑色素細胞的方法，其特征在于，其包括； a) 制備表皮細胞混懸液：取材，消化，剝離表皮收集皮片，消化，用權利要求1所述的培 養(yǎng)液A終止消化，收集細胞混懸液。離心后加入培養(yǎng)液A ; b) 臨床治療級細胞治療用黑色素細胞的篩選及培養(yǎng)：將權利要求7所述的高擬體內(nèi)細 胞外基質(zhì)加入權利要求1所述的培養(yǎng)液B，加入步驟a)制備的細胞懸液，培養(yǎng)，清洗，目標臨 床治療級細胞治療用黑色素細胞壁粘附于高擬體內(nèi)細胞外基質(zhì)，加入權利要求1所述的培 養(yǎng)液C進行擴增培養(yǎng)； c) 消化富集傳代培養(yǎng)：消化，離心后加入權利要求1所述的培養(yǎng)液C進行擴增培養(yǎng)；免 疫逃逸方法處理取材前皮膚或獲得細胞；10. 按權利要求9所述的方法，其特征在于，所述的免疫逃逸方法為射線法或低溫凍融 法。
【專利摘要】本發(fā)明公開了臨床治療級細胞治療用黑色素細胞(melanocytes)創(chuàng)新培養(yǎng)方法。黑色素細胞培養(yǎng)、篩選、擴增技術，這些瓶頸一直是生物學細胞領域研究熱點和難點，目前利用貼壁特性進行分離并采用三維培養(yǎng)擴增手段獲得。該發(fā)明適合依賴擴增貼壁型細胞并提供三維高擬體內(nèi)細胞外基質(zhì)系統(tǒng)進行目標細胞水平的篩選與分離。高模擬體內(nèi)貼附環(huán)境，體外培養(yǎng)成體(胚胎皮膚)細胞的生物細胞新培養(yǎng)技術。高模擬底物所在環(huán)境黏附篩選培養(yǎng)目標黑色素細胞，具有高傳代能力，高增殖能力。篩出免疫原性細胞安全獲得免疫逃逸，延長移植時間增加組織工程臨床應用，促進創(chuàng)面色素愈合與治療色素異常性皮膚病(白癜風)提供了絕對優(yōu)勢臨床治療級細胞的解決方案。
【IPC分類】C12N5/071
【公開號】CN105238739
【申請?zhí)枴緾N201510762700
【發(fā)明人】朱寧文, 王凌儀, 李世榮, 曹川 , 楊軍, 劉凱
【申請人】朱寧文
【公開日】2016年1月13日
【申請日】2015年11月11日