的I gG-Fab的結(jié)合反應(yīng)曲線圖。
[004引圖3是W:野生型SpG-m的二聚體、V:本發(fā)明中得到的突變型SpG-m的二聚體對于 抗TNFa單克隆抗體的IgG-Fab的結(jié)合反應(yīng)曲線圖。
【具體實施方式】
[0049] 本發(fā)明的化b區(qū)域結(jié)合性膚（1)是具有G蛋白（SpG)的m結(jié)構(gòu)域來源的氨基酸序列 (序列號1)中選自第13位、第19位、第30位和第33位的1個W上位點的氨基酸殘基被置換的 氨基酸序列、并且與免疫球蛋白的Fab區(qū)域的結(jié)合力高于導(dǎo)入置換前的Fab區(qū)域結(jié)合性膚。
[0050] "免疫球蛋白"是淋己細胞的B細胞所產(chǎn)生的糖蛋白，具有識別特定的蛋白質(zhì)等分 子并進行結(jié)合的作用。免疫球蛋白具有與該特定的分子(抗原)進行特異性結(jié)合的功能、W 及與其他的生物分子、細胞協(xié)同對具有抗原的因子進行解毒?去除的功能。免疫球蛋白一 般被稱為"抗體"，但運是著眼于運種功能的名稱。所有的免疫球蛋白基本上由相同的分子 結(jié)構(gòu)組成，Κ?'字型的4鏈結(jié)構(gòu)(輕鏈?重鏈的2條多膚鏈各2條)作為基本結(jié)構(gòu)。輕鏈化鏈） 有λ鏈和K鏈的兩種，所有的免疫球蛋白都具有其中任一個。重鏈化鏈)有丫鏈、μ鏈、α鏈、δ 鏈、ε鏈運樣結(jié)構(gòu)不同的5種，根據(jù)該重鏈的不同免疫球蛋白的種類（同種型)發(fā)生變化。免疫 球蛋白G(W下有時簡稱為"IgG")為單體型的免疫球蛋白，由2條重鏈（丫鏈)和2條輕鏈構(gòu) 成，具有2處抗原結(jié)合位點。
[0051] 將對應(yīng)于免疫球蛋白的?'字的下半部分的豎條部分的位置稱為化區(qū)域，將上半 部分的?'字的部分稱為Fab區(qū)域。Fc區(qū)域具有引起抗體與抗原結(jié)合后的反應(yīng)的效應(yīng)功能， Fab區(qū)域具有與抗原結(jié)合的功能。重鏈的化b區(qū)域和化區(qū)域通過較鏈部而連接，番木瓜中所 含的蛋白質(zhì)分解酶木瓜蛋白酶分解該較鏈部并切割為2個化b區(qū)域(片段)和1個Fc區(qū)域。Fab 區(qū)域中靠近?'字前端的部分(結(jié)構(gòu)域)的氨基酸序列中有各種各樣的變化W便可與多樣的 抗原進行結(jié)合，所W被稱為可變區(qū)(V區(qū)）。輕鏈的可變區(qū)稱為VL區(qū)，重鏈的可變區(qū)稱為VH區(qū)。 除了 V區(qū)W外的Fab區(qū)域和Fc區(qū)域是變化較少的區(qū)域，稱為恒定區(qū)（C區(qū)）。輕鏈的恒定區(qū)稱為 化區(qū)，重鏈的恒定區(qū)稱為CH區(qū)，CH區(qū)進而分為CH1~CH3的3個。重鏈的化b區(qū)域包括VH區(qū)和 CH1，重鏈的化區(qū)域包括C肥和C冊。較鏈部位于CH巧日C肥之間。更詳細地，SpG-β與IgG的結(jié)合 是與IgG的CH1區(qū)（CH1 丫）和CL區(qū)的結(jié)合，特別是與CH1的結(jié)合為主(非專利文獻5)。
[0052] 本發(fā)明的Fa啦域結(jié)合性膚與IgG的Fab區(qū)域結(jié)合。本發(fā)明膚應(yīng)結(jié)合的含F(xiàn)ab區(qū)域的 蛋白質(zhì)只要含有化b區(qū)域即可，也可為不充足地含有化b區(qū)域和化區(qū)域的IgG分子，也可為 IgG分子的衍生物。本發(fā)明的化b區(qū)域結(jié)合性膚所結(jié)合的IgG分子衍生物只要為具有化b區(qū)域 的衍生物則沒有特別限制。例如可舉出：僅在IgG的Fab區(qū)域被片段化了的Fab片段、使人IgG 的一部分的結(jié)構(gòu)域置換為其他的生物種的IgG的結(jié)構(gòu)域并融合的嵌合型IgG、在Fc區(qū)域的糖 鏈上進行了分子改變后的IgG、共價結(jié)合了藥劑的化b片段等。
[0053] 本發(fā)明中"膚"是指包括具有多膚結(jié)構(gòu)的所有分子的物質(zhì)，不僅包括所謂的蛋白 質(zhì)，而且還包括被片段化的物質(zhì)、通過膚鍵等而連接了其他膚的物質(zhì)。
[0054] %蛋白（SpG)"是G組的鏈球菌（Sheptococ州S sp.)的細胞壁來源的蛋白質(zhì)。SpG 具有與大部分的哺乳類的IgG進行結(jié)合的能力，與IgG的化區(qū)域較強地結(jié)合，與IgG的化b區(qū) 域也較弱地結(jié)合。
[0055] SpG的表現(xiàn)出與IgG結(jié)合性的功能域被稱為β結(jié)構(gòu)域(SpG-β)。需要說明的是，存在 稱為0(B)結(jié)構(gòu)域和稱為C結(jié)構(gòu)域的兩種情況(參照Akerstrom et al. J.Biol.Chem. ,1987， 28,13388-,Fig. 5)，本說明書中根據(jù)等的定義稱為β結(jié)構(gòu)域（Fahnestock et al.'J.Bacteriol.,1986,167,870-)。
[0056] SpG-β的氨基酸序列根據(jù)所來源的細菌種類、細菌菌株的不同有細部的不同。作為 代表性的氨基酸序列，對于來自G組的鏈球菌的GX7809株的2個β結(jié)構(gòu)域(β巧郵2)而言，將m 結(jié)構(gòu)域(SpG-βΙ)的第1位的Asp置換為化r的氨基酸序列表示為序列號1，將的結(jié)構(gòu)域(SpG-β 2)的氨基酸序列表示為序列號2dSpG的各β結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列之間的序列同源性高，將運 些概括稱為G蛋白-β結(jié)構(gòu)域(SpG-β)。需要說明的是，來自GX7809株的SpG-的的第1位為化r。 另外，根據(jù)文獻也有將序列號1和序列號2的第2位及其后的序列作為SpG的各結(jié)構(gòu)域的氨基 酸序列的，上述的置換不會影響具有序列號1的氨基酸序列的膚與化b區(qū)域的親和性。
[0057] 需要說明的是，根據(jù)Alexander等示出了P冊.4時的變性中點溫度，SpG-βΙ為87.5 °C，SpG-的為79.4°C(Alexander et al.，Biochemist巧，1992，31，3597-)。因此，作為本發(fā) 明的優(yōu)選實施方式之一，從膚的熱穩(wěn)定性的觀點考慮，可舉出將SpG-m(序列號1)作為突變 導(dǎo)入對象。然而，只要通過在氨基酸序列中加入突變而最終得到的氨基酸序列包含在本發(fā) 明的范圍內(nèi)，突變導(dǎo)入對象并不限定于SpG-m(序列號1)。例如，也可將SpG-i32(序列號2)、 作為G組的鏈球菌的G148株、GX7805株來源的SpG中所含的3個IgG結(jié)合性結(jié)構(gòu)域的N末端側(cè) 開始第2個結(jié)構(gòu)域（SPG-C2)、熱穩(wěn)定性優(yōu)異的已知的SpG突變體（參照國際公開第1997-026930號公報、日本特開2003-88381號公報)等作為突變導(dǎo)入對象。
[0058] "結(jié)構(gòu)域"是指蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)上的單位，由數(shù)十至數(shù)百氨基酸殘基序列構(gòu)成， 是指足夠表現(xiàn)出一些物理化學(xué)或生物化學(xué)功能的蛋白質(zhì)的單位。
[0059] 蛋白質(zhì)、膚的"突變體"是指在氨基酸水平上對于野生型的蛋白質(zhì)、膚的序列導(dǎo)入 了至少1個W上的置換、添加或缺失的蛋白質(zhì)或膚。
[0060] 本發(fā)明設(shè)及具有在野生型SpG-β中導(dǎo)入了突變的序列的膚，導(dǎo)入該突變前的氨基 酸序列是序列號1所示的spG-m的氨基酸序列。其中，只要包含在本發(fā)明的化b區(qū)域結(jié)合性 膚（1)~(3)的任一范圍內(nèi)，即使為使序列號2的氨基酸序列突變的結(jié)果而得到的膚也包含 在本發(fā)明范圍內(nèi)。
[0061] 對于置換氨基酸的突變的標(biāo)記而言，在置換位點的編號前附加野生型或非突變型 的氨基酸殘基，在置換位點的編號后附加突變后的氨基酸殘基來進行標(biāo)記。例如，將第29位 的Gly置換為Ala的突變標(biāo)記為G29A。
[0062] 本發(fā)明是通過對野生型的SpG的m結(jié)構(gòu)域?qū)氚被嶂脫Q突變，從而創(chuàng)制出與免 疫球蛋白G的化b區(qū)域的結(jié)合力高于導(dǎo)入氨基酸突變前的突變體的技術(shù)。本發(fā)明的氨基酸殘 基的置換位點是在序列號1的氨基酸序列中第13位化ys)、第19位(Glu)、第30位(Phe)或第 33位(Tyr)的任一位點。即使在導(dǎo)入突變前的氨基酸序列的氨基酸數(shù)不同的情況下，序列一 致性為80% W上時，作為本領(lǐng)域技術(shù)人員也能夠容易地對相當(dāng)于序列號1的第13位、第19 位、第30位或第33位的位點進行鑒定。具體而言，可通過作為氨基酸序列多重比對用程序的 Clus1:al(ht1:p://www. clus1:al .org/omega/)來進行比對確定。
[0063] 本發(fā)明的化b區(qū)域結(jié)合性膚（1)具有G蛋白的m結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列（序列號1)中 選自第13位、第19位、第30位和第33位的1個W上位點的氨基酸殘基被置換的氨基酸序列。 突變的氨基酸的種類包括置換為非蛋白質(zhì)構(gòu)成氨基酸、非天然氨基酸，沒有特別限定，但從 基因工程生產(chǎn)的的觀點考慮，可優(yōu)選使用天然型氨基酸。而且，天然型氨基酸分為中性氨基 酸;Asp和Glu的酸性氨基酸;Lys、Arg、His的堿性氨基酸。中性氨基酸分為脂肪族氨基酸； Pro的亞氨基酸;Phe、Tyr、T巧的芳香族氨基酸。脂肪族氨基酸進而分為Gly;Ala;Val、Leu、 lie的支鏈氨基酸；Ser、Thr的徑基氨基酸;切S、Met的含硫氨基酸;Asn、Gln的酷胺氨基酸。 另外，由于Tyr具有酪徑基，所W不僅可分類為芳香族氨基酸也可分類為徑基氨基酸。而且， 從其他的觀點考慮，也可將天然氨基酸分為61γ、Α?3、ν3?αθ?ι、Ι1θ、?ΥρΧ73、Μθ?、ΡΓ〇、Ι%θ 的疏水性高的非極性氨基酸類;4311、61]1、5日1'、化1'、了71'的中性的極性氨基酸類;439、6111的 酸性的極性氨基酸類;Lys、ArgJis的堿性的極性氨基酸類。只要利用上述位點的氨基酸殘 基被置換的膚能夠提高與化b區(qū)域結(jié)合力，則利用使置換氨基酸突變?yōu)榕c上述分類同類的 氨基酸的膚，也能夠同樣地提高與化b區(qū)域結(jié)合力的可能性很高。
[0064] 關(guān)于本發(fā)明中的置換突變，優(yōu)選包括第13位的氨基酸殘基被置換為化r或Ser的突 變、第30位的氨基酸殘基被置換為化l、Leu或lie的突變、和/或第19位的氨基酸殘基被置換 為VaULeu或lie的突變。而且，更優(yōu)選包括第13位的氨基酸殘基被置換為化r或Ser的突變、 并且包括第30位的氨基酸殘基被置換為VaULeu或lie的突變、和/或第19位的氨基酸殘基 被置換為VaKLeu或lie的突變。而且，更優(yōu)選包括第13位的氨基酸殘基被置換為化r或Ser 的突變、并且包括第30位的氨基酸殘基被置換為VaKLeu或lie的突變和/或第19位的氨基 酸殘基被置換為lie或化1的突變、并且包括第33位的氨基酸殘基被置換為化e的突變。第30 位的氨基酸殘基更優(yōu)選被置換為Leu,第19位的氨基酸殘基更優(yōu)選被置換為化1或lie。
[006引本發(fā)明的化b區(qū)域結(jié)合性膚（1)顯示出與IgG的化b區(qū)域的結(jié)合力高于導(dǎo)入氨基酸 置換前運樣的特征。對于IgG的化b區(qū)域的親和性例如可通過使用了表面等離子體共振原理 的Biacore系統(tǒng)(GE化althcare公司）等的生物傳感器來進行試驗，但并不限定于此。
[0066] 作為對于Fab區(qū)域的結(jié)合性的測定條件，只要能夠檢測出與IgG的Fab區(qū)域結(jié)合時 的結(jié)合信號即可?？赏ㄟ^在20~40°C的一定溫度且P冊~8的中性條件下進行測定而簡單地 進行評價。
[0067] 結(jié)合對象的IgG分子只要能夠檢測出與化b區(qū)域的結(jié)合則沒有特別限定，但由于使 用含F(xiàn)c區(qū)域的IgG分子時也能夠檢測出與Fc區(qū)域的結(jié)合，所W優(yōu)選使用W排除Fc區(qū)域的方 式對化b區(qū)域進行片段化并進行分離純化的化b段。對于親和性的差異，可在相同測定條件 下，得到對相同IgG分子的結(jié)合反應(yīng)曲線，利用在進行解析時得到的結(jié)合參數(shù)，通過對導(dǎo)入 突變前的膚和導(dǎo)入突變后的膚進行比較，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠容易地進行驗證。
[0068] 作為結(jié)合參數(shù)，例如可使用親和常數(shù)化A)、解離常數(shù)化D)(永田等著，"生物