傾向相似，所W可認為本發(fā)明中得到的突變體并非與IgG-Fab的抗原結(jié)合區(qū)域（由于抗體的 種類不同而序列有很大不同的部分)結(jié)合，而是與恒定區(qū)等在各種各樣的抗體中共通的區(qū) 域結(jié)合。因此，可認為得到的結(jié)果證明了本發(fā)明中得到的突變體作為親和配體的通用性高。
[0132] 由于相對于GST-Sp地 1-Wild. ld，GST-SpGm-K13T. Id顯示出2倍W上的IgG-Fab結(jié) 合力，所W可認為，突變K13T是在單獨時有助于提高IgG-Fab結(jié)合力的突變。其它地，由于能 夠在多個突變體中發(fā)現(xiàn)突變F3化，所W在運次被導(dǎo)入了突變體的突變中，除了K13TW外，突 變F3化特別有助于提高IgG-Fab結(jié)合力的可能性很大。
[0133] 實施例3
[0134] 與上述實施例2的實驗相同地測定了 SpG-β 1突變體對于I gG-化b的親和性。對于 IgG-Fab而言，在上述實施例2的實驗中，對于在一種IgG-化b中觀察到的結(jié)果而言，由于確 認了在其他種類的IgG-Fab中也觀察到大致相同的傾向，所W僅對一種進行了實驗。結(jié)果示 于表2。
[013 引[表 2]
[0136]
[0137] 如表2示出的結(jié)果所述，GST-Sp地 1-K13T/F30L/D36G. Id與GST-Sp地 1-Wild. Id相 比，與IgG-Fab的結(jié)合力為6倍左右?？烧J為，該結(jié)果與在上述實施例2的實驗中為5倍左右的 結(jié)果并不矛盾。需要說明的是，由于伴隨傳感器忍片上的IgG-化b的重復(fù)再生的劣化、伴隨 濃度調(diào)整等手動操作的誤差，因而可認為在實驗期間結(jié)合參數(shù)在數(shù)值上產(chǎn)生運種程度的偏 差是自然的事。
[0138] 另外，對于突變K13T而言，與之前相同地觀察到對提高與IgG-Fab結(jié)合力的幫助很 大，可認為突變K13S也具有相近的效果。另外，突變F3化、突變E19I和E19V也是能夠觀察到 與顯示出5倍W上IgG-Fab結(jié)合力的突變體大致相同的突變，可認為對提高IgG-Fab結(jié)合力 的幫助很大。特別是，也可認為突變K13T與K13S-致地提高了 IgG-Fab結(jié)合力。
[0139] 除運些之外，Y33F也是在突變體中比較常見的突變，可認為有助于提高IgG-Fab結(jié) 合力。總體而言，其他的突變也存在有助于提高IgG-化b結(jié)合力的可能性。另外，第13位、第 19位、第30位和第33位中的突變只要與SpG-βΙ的序列一致性為80% W上，就可認為能夠發(fā) 揮基本相同的功能。
[0140] 實施例4
[0141] 與上述實施例3的實驗相同地測定了SpG-βΙ突變體對于IgG-Fab的親和性。在該實 驗中，用切割GST后的GST切割型(Pep-)實施了測定。另外，不僅使用1結(jié)構(gòu)域類型(Pep. Id)， 而且使用在C末端結(jié)合了切s的1結(jié)構(gòu)域類型(Pep. IdC)和在C末端結(jié)合了切s的2結(jié)構(gòu)域類型 化ep. 2dC)進行了實驗。將該結(jié)果示于表3。
[014引[表 3]
[0143]
[0144] 如表3示出的結(jié)果所述，與之前相同地，與野生型相比，通過本發(fā)明得到的突變體 表現(xiàn)出顯著高的IgG-化b親和性。需要說明的是，切割GST后的化p-Sp地l-Wild.ld與GST-Sp地l-Wild.ld相比較，由于解離速率常數(shù)大因而結(jié)合常數(shù)變小?？紤]到作為親和配體進行 工業(yè)生產(chǎn)時，由于沒有特意地融合GST的必要性，所W可認為在切割該GST后的條件下的比 較是更接近實際使用條件的比較。
[0145] 與化p-Sp 地 1-胖11(1.1村目比，？巧-5口地1-1(131'作191/￥210/了251/。3化/￥33。/^35尸/ D47A. Id與實施例3的情況相同地表現(xiàn)出顯著高的IgG-Fab親和性。該親和性的提高是在切 割了GST的化P型的情況下，W結(jié)合常數(shù)計為近30倍的值。
[0146] 另外，與化p-Sp地1-Wild. Id相比，本發(fā)明中得到的作為其他突變體的化p-Sp地1-K13T/T18A/E19I/V21A/K28I/F30L/Y33F/V39I.ld和Pep-Sp地1-K10R/K13T/T18A/E19I/ V21D/T25M/F30L/Y33F/N35F/D47A. Id也表現(xiàn)出顯著高的IgG-Fab親和性。
[0147] 而且，與化 p-Sp 地 1-胖11(1.1村目比，？69-59地1-1(101?/1(131'/1'184作191八210/了251/ F30L/Y33F/N35F/D47A.ld顯示出80倍W上高的結(jié)合常數(shù)，WKa計顯示出107M-i數(shù)量級。
[0148] 用在1結(jié)構(gòu)域類型中使切S結(jié)合至C末端的結(jié)構(gòu)進行比較時也得到了相同的結(jié)果。 用在2結(jié)構(gòu)域類型中使切S結(jié)合至C末端的結(jié)構(gòu)進行比較時也得到了相同的結(jié)果，但化p-SpG m-K10R/K13T/T18A/E19I/V21D/T25M/F30L/Y33F/N35F/D47A.2dC 與化 p-Sp 地 l-Wild.2dC 相比，顯示出200倍W上高的結(jié)合常數(shù)。
[0149] 為便于參考，使用相同類型的結(jié)構(gòu)(Pep. Id或化p.2dC)，作為圖2示出對相同蛋白 質(zhì)濃度（2μΜ)中的、野生型SpG-m與K10R/K13T/T18A/E19I/V21D/T25M/F30L/Y33F/N35F/ D47A對于抗TNFa單克隆抗體的IgG-Fab的biacore結(jié)合反應(yīng)曲線進行重疊比較的圖。另外， 作為圖3示出對運些二聚體的相對于抗TNFa單克隆抗體的IgG-Fab的biacore結(jié)合反應(yīng)曲線 重疊并進行比較的圖。如圖2和圖3所示，可知無論是結(jié)構(gòu)域單體型膚還是結(jié)構(gòu)域二聚體型 膚，本發(fā)明的突變型膚與野生型SpG-化相比，對化b區(qū)域具有高的結(jié)合能力。
[0150] 另外，圖2的野生型SpG-m的結(jié)合反應(yīng)曲線顯示出在結(jié)合速率常數(shù)大(相互作用的 解離快)時所觀察到的典型的"箱型"的形狀。"箱型"是指添加樣品時(結(jié)合相）的信號的上 升快并且立刻結(jié)合達到平衡狀態(tài)(信號平行于基線），添加樣品停止時(解離相)的信號降低 也快時所觀察到的形狀。與此相比較，由于本發(fā)明中得到的突變型SpG-βΙ的解離速率常數(shù) 小，所W添加樣品停止時的信號降低顯示出平緩的形狀。因此，可W期待固定化了本發(fā)明的 突變型SpG-化的親和分離基質(zhì)對含有化b區(qū)域的蛋白質(zhì)的保持性能極高。
【主權(quán)項】
1. 一種Fab區(qū)域結(jié)合性肽，其為下述(1)~(3)的任一者： (1) 具有來自G蛋白的m結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列即序列號1中選自第13位、第19位、第30位 和第33位的1個以上位點的氨基酸殘基被置換的氨基酸序列、并且與免疫球蛋白的Fab區(qū)域 的結(jié)合力高于導(dǎo)入置換前的Fab區(qū)域結(jié)合性肽； (2) 具有所述（1)規(guī)定的氨基酸序列中除了所述第13位、第19位、第30位和第33位以外 的區(qū)域中缺失、置換和/或添加了 1個以上、20個以下的氨基酸殘基的氨基酸序列、并且與免 疫球蛋白的Fab區(qū)域的結(jié)合力高于具有序列號1的氨基酸序列的肽的Fab區(qū)域結(jié)合性肽;或 者 (3) 具有相對于所述（1)中規(guī)定的氨基酸序列具有80%以上的序列一致性的氨基酸序 列、并且與免疫球蛋白的Fab區(qū)域的結(jié)合力高于具有序列號1的氨基酸序列的肽的Fab區(qū)域 結(jié)合性肽，其中，所述（1)規(guī)定的氨基酸序列中的選自第13位、第19位、第30位和第33位的1 個以上位點的氨基酸殘基的置換在(3)中不進一步突變。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的Fab區(qū)域結(jié)合性肽，其中，所述（1)規(guī)定的氨基酸序列中，第13 位的位點的氨基酸殘基被置換。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的Fab區(qū)域結(jié)合性肽，其中，第13位的氨基酸殘基被置換成Thr或 Ser〇4. 根據(jù)權(quán)利要求1~3的任一項所述的Fab區(qū)域結(jié)合性肽，其中，所述（1)規(guī)定的氨基酸 序列中，第30位的氨基酸殘基被置換成Val、Leu或Ile。5. 根據(jù)權(quán)利要求1~4的任一項所述的Fab區(qū)域結(jié)合性肽，其中，所述（1)規(guī)定的氨基酸 序列中，第19位的氨基酸殘基被置換成Val、Leu或lie。6. 根據(jù)權(quán)利要求1~5的任一項所述的Fab區(qū)域結(jié)合性肽，其中，所述（1)規(guī)定的氨基酸 序列中，第33位的氨基酸殘基被置換成Phe。7. 根據(jù)權(quán)利要求1~6的任一項所述的Fab區(qū)域結(jié)合性肽，其中，所述(2)規(guī)定的氨基酸 序列中，進行了所述缺失、置換和/或添加的氨基酸殘基的位點為選自第2位、第10位、第15 位、第18位、第21位、第22位、第23位、第24位、第25位、第27位、第28位、第31位、第32位、第35 位、第36位、第39位、第40位、第42位、第45位、第47位和第48位的1個以上。8. 根據(jù)權(quán)利要求1~6的任一項所述的Fab區(qū)域結(jié)合性肽，其中，所述(2)規(guī)定的氨基酸 序列中，進行了所述缺失、置換和/或添加的氨基酸殘基的位點為N末端和/或C末端。9. 根據(jù)權(quán)利要求1~8的任一項所述的Fab區(qū)域結(jié)合性肽，其中，所述(3)規(guī)定的氨基酸 序列中，所述序列一致性為95%以上。10. -種Fab區(qū)域結(jié)合性肽多聚體，其特征在于，具有連接了 2個以上權(quán)利要求1~9的任 一項所述的Fab區(qū)域結(jié)合性肽的多個結(jié)構(gòu)域。11. 一種親和分離基質(zhì)，其特征在于，權(quán)利要求1~9的任一項所述的Fab區(qū)域結(jié)合性肽 或者權(quán)利要求10所述的Fab區(qū)域結(jié)合性肽多聚體作為配體被固定化于水不溶性載體。12. -種制造包含F(xiàn)ab區(qū)域的蛋白質(zhì)的方法，其特征在于，包括： 使權(quán)利要求11所述的親和分離基質(zhì)與含有包含F(xiàn)ab區(qū)域的蛋白質(zhì)的液體試樣接觸的工 序;和 從親和分離基質(zhì)中分離與親和分離基質(zhì)結(jié)合的包含F(xiàn)ab區(qū)域的蛋白質(zhì)的工序。13. -種DNA，其特征在于，編碼權(quán)利要求1~9的任一項所述的Fab區(qū)域結(jié)合性肽。14. 一種載體，其特征在于，包含權(quán)利要求13所述的DNA。15. -種轉(zhuǎn)化體，其特征在于，其是由權(quán)利要求14所述的載體轉(zhuǎn)化而成的。
【專利摘要】本發(fā)明的目的在于提供對于IgG的Fab區(qū)域的結(jié)合能力極其優(yōu)異的Fab區(qū)域結(jié)合性肽、具有該肽作為配體的親和分離基質(zhì)、以及使用了該親和分離基質(zhì)的含F(xiàn)ab區(qū)域蛋白質(zhì)的制造方法。另外，本發(fā)明的目的還在于提供編碼該肽的DNA、包含該DNA的載體、以及利用該載體而轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化體。本發(fā)明的Fab區(qū)域結(jié)合性肽的特征在于與野生型SpG-β1相比在特定位點具有突變。
【IPC分類】C12N1/21, C07K17/00, C12N15/09, C12N5/10, C07K1/22, C12N1/19, C07K14/315, C12N1/15
【公開號】CN105518023
【申請?zhí)枴緾N201480048054
【發(fā)明人】吉田慎一, 村田大
【申請人】株式會社鐘化
【公開日】2016年4月20日
【申請日】2014年8月28日
【公告號】EP3040344A1, WO2015030094A1