含IgG的化b區(qū)域的膚而完成高純度的純化。
[0089] 通過使配體化合物、載體的基材不會完全地?fù)p害功能的程度的、適當(dāng)?shù)膹?qiáng)酸性或 強(qiáng)堿性的純粹的緩沖液(也存在含有適當(dāng)變性劑或有機(jī)溶劑的溶液的情況)通過而清洗本 發(fā)明的親和分離基質(zhì)，從而可進(jìn)行再利用。
[0090] 本發(fā)明也設(shè)及編碼本發(fā)明的膚的DNA。編碼本發(fā)明膚的DNA只要翻譯其堿基序列的 氨基酸序列為構(gòu)成該膚的序列，則可為任意一種。運樣的堿基序列可利用通常使用的已知 的方法例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)下簡稱為"PCR")法取得。另外，也可通過已知的化學(xué)合成法 進(jìn)行合成，進(jìn)而也可由DNA文庫獲得。該堿基序列的密碼子也可被簡并密碼子置換，只要在 被翻譯時對相同的氨基酸進(jìn)行編碼就不需要與原來的堿基序列相同?？傻玫剑壕哂幸粋€或 多個該堿基序列的重組DNA、或者含有該重組DNA的質(zhì)粒和隧菌體等載體、進(jìn)而通過具有該 DM的載體而轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化微生物/細(xì)胞、或者導(dǎo)入了該DM的轉(zhuǎn)基因生物、或者將該DM作為 轉(zhuǎn)錄的模板DNA的無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)。
[0091] 另外，本發(fā)明的化b區(qū)域結(jié)合性膚也可作為與具有輔助蛋白質(zhì)表達(dá)的作用或易于 純化運一優(yōu)點的已知的蛋白質(zhì)的融合膚而取得。即，可W獲得含有至少一個對含有本發(fā)明 的Fab區(qū)域結(jié)合性膚的融合膚進(jìn)行編碼的重組DNA的微生物或細(xì)胞。作為上述蛋白質(zhì)的例 子，可舉出麥芽糖結(jié)合蛋白（MBP)、谷脫甘膚-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)等，但并不限定于運些蛋白質(zhì)。
[0092] 如下所示，可W使用重組DNA技術(shù)、PCR法等導(dǎo)入用于改變對本發(fā)明的膚進(jìn)行編碼 的DNA的定點突變。
[0093] 目P，通過重組DNA技術(shù)的突變的導(dǎo)入，例如也可通過盒式突變法來進(jìn)行，所述盒式 突變法是在編碼本發(fā)明膚的基因中，在希望導(dǎo)入突變的目標(biāo)位點的兩側(cè)存在適當(dāng)?shù)南拗泼?識別序列時，通過限制酶切割運些限制酶識別序列部分，去除包含希望導(dǎo)入突變的位點的 區(qū)域后，利用化學(xué)合成等僅在目標(biāo)位點插入導(dǎo)入突變后的DNA片段。
[0094] 另外，通過PCR的定點突變的導(dǎo)入例如也可通過雙引物法來進(jìn)行，所述雙引物法是 將編碼本發(fā)明膚的雙鏈質(zhì)粒作為模板，使用與+鏈和-鏈互補(bǔ)的包含突變的兩種合成寡引物 進(jìn)行PCR。
[0095] 另外，也可W通過將編碼本發(fā)明的單體膚（1個結(jié)構(gòu)域)的DNA僅W期望的數(shù)進(jìn)行串 聯(lián)連接來制作編碼多聚體膚的DNA。例如，編碼多聚體膚的DNA的連接方法可W在DNA序列導(dǎo) 入適當(dāng)?shù)南拗泼肝稽c，通過DNA連接酶連接用限制酶進(jìn)行了片段化的雙鏈DNA。限制酶位點 可導(dǎo)入一種或多個不同種類的限制酶位點。另外，在編碼多聚體膚的DNA中，編碼各個單體 膚的堿基序列是相同的情況下，由于有通過宿主會誘發(fā)同源重組的可能性，所W對被連接 的單體膚進(jìn)行編碼的DNA的堿基序列之間的序列一致性為90% W下，優(yōu)選為85% W下，更優(yōu) 選為80% W下，進(jìn)而更優(yōu)選為75% W下。需要說明的是，堿基序列的一致性也可與氨基酸序 列相同地通過常規(guī)方法來決定。
[0096] 本發(fā)明的"表達(dá)載體"含有可對前述的本發(fā)明膚或其部分氨基酸序列進(jìn)行編碼的 堿基序列、W及可工作地連接于該堿基序列的在宿主中能夠發(fā)揮作用的啟動子。一般情況 下，可通過將編碼本發(fā)明膚的基因與適當(dāng)?shù)妮d體進(jìn)行連接或者插入而獲得，用于插入基因 的載體只要是在宿主中可進(jìn)行自主復(fù)制的物質(zhì)則沒有特別限定，可使用質(zhì)粒DNA、隧菌體 DNA作為載體。例如，在使用大腸菌作為宿主時，可舉出：P犯系載體(如iagen公司）、祀T系載 體(Merck公司）和pGEX系載體(GE Healthcare Bio-Sciences公司）的載體等。
[0097] 本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體可通過向作為宿主的細(xì)胞導(dǎo)入本發(fā)明的重組載體而獲得。作為向 宿主導(dǎo)入重組體DNA的方法，例如可舉出：使用巧離子的方法、電穿孔法、原生質(zhì)球法、乙酸 鐘法、農(nóng)桿菌感染法、基因槍法和聚乙二醇法等，但并不限定于運些。另外，作為通過宿主表 達(dá)所得到的基因的功能的方法，也可舉出將本發(fā)明中得到的基因重組入基因組(染色體)的 方法等。對于作為宿主的細(xì)胞而言，并沒有特別限定，為了低成本地大量生產(chǎn)，可優(yōu)選使用 大腸桿菌、枯草桿菌、短小芽胞桿菌屬、葡萄球菌屬、鏈球菌屬、鏈霉菌屬（Streptomyces)、 棒狀桿菌屬(Corynebacterium)等細(xì)菌(真細(xì)菌）。
[0098] 本發(fā)明的化b區(qū)域結(jié)合性膚可通過如下方式進(jìn)行制造:在培養(yǎng)基中培養(yǎng)前述的轉(zhuǎn) 化體，使本發(fā)明膚在培養(yǎng)菌體中（也包含菌體周質(zhì)區(qū)域中）或培養(yǎng)液中（菌體外）生成蓄積， 從該培養(yǎng)物中提取所期望的膚。另外，本發(fā)明膚也可通過下述方式進(jìn)行制造:在培養(yǎng)基中培 養(yǎng)前述的轉(zhuǎn)化體，使含有本發(fā)明膚的融合蛋白質(zhì)在培養(yǎng)菌體中（也包含菌體周質(zhì)區(qū)域中）或 培養(yǎng)液中（菌體外）生成蓄積，從該培養(yǎng)物中提取該融合膚，將該融合膚用合適的蛋白酶切 害d，提取所期望的膚。
[0099] 在培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體的方法可按照用于培養(yǎng)宿主的一般的方法來進(jìn) 行。用于培養(yǎng)得到的轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)基只要是能夠W高效率、高產(chǎn)量生產(chǎn)本發(fā)明膚的物質(zhì)則 沒有特別限制。具體而言，可使用葡萄糖、薦糖、甘油、多聚蛋白腺、肉提取物、酵母提取物、 酪蛋白氨基酸等碳源、氮源。其它可根據(jù)需要添加鐘鹽、鋼鹽、憐酸鹽、儀鹽、儘鹽、鋒鹽、鐵 鹽等無機(jī)鹽類。在使用營養(yǎng)缺陷型的宿主細(xì)胞時，只要添加生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)即可。另 夕h如果需要也可添加青霉素、紅霉素、氯霉素、新霉素等抗生素。
[0100] 而且，為了抑制由存在于菌體內(nèi)外的來自宿主的蛋白酶所致的該目標(biāo)膚的分解， 也可適當(dāng)?shù)臐舛忍砑右阎母鞣N蛋白酶抑制劑、即苯甲基橫酷氣（Phenylmethane sulf onyl fluoride , PMSF)、苯甲脈（Benzamidine)、4-(2-氨乙基）苯橫酷氣（4-(2-aminoethyl )-benzenesu If onyl fluoride ,AEBSF)、抗蛋白酶（Antipain )、糜蛋白酶素 (Chymostatin)、亮抑酶膚化e叩eptin)、胃蛋白酶抑制劑（PepstatinA)、憐酷二膚 (Phosphoramidon)、抑膚酉每（Aprotinin)、乙二胺四乙酉《（Ethylenediaminetetra acetic acid,邸ΤΑ)和/或其他市售的蛋白酶抑制劑。
[0101] 而且，為了使本發(fā)明的化b區(qū)域結(jié)合性膚進(jìn)行正確折疊，例如也可利用GroEL/ES、 化p70/DnaK、Hsp90、Hspl04/Cl地等分子伴侶(例如通過共表達(dá)或融合蛋白化等方法使其與 本發(fā)明的膚共存）。需要說明的是，在W正確折疊本發(fā)明膚為目的時，也有在培養(yǎng)基中添加 促進(jìn)正確的折疊的添加劑W及在低溫下進(jìn)行培養(yǎng)等的方法，但并不限定于運些。
[0102] 作為對W大腸菌作為宿主得到的轉(zhuǎn)化細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)的培養(yǎng)基，可舉出LB培養(yǎng)基 (膜蛋白腺1 %，酵母提取物0.5 %，化C1 1 % )或2 X YT培養(yǎng)基(膜蛋白腺0.6 %，酵母提取物 1.0%，NaCl 0.5%)等。
[0103] 另外，通過在培養(yǎng)溫度例如15~42°C，優(yōu)選為在20~37°C、通氣攬拌條件下有氧培 養(yǎng)數(shù)小時~數(shù)天，在培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)（包括周質(zhì)區(qū)域內(nèi)）或培養(yǎng)溶液(細(xì)胞外)使本發(fā)明膚蓄積并 進(jìn)行回收。也可根據(jù)情況停止通氣進(jìn)行厭氧性培養(yǎng)。在分泌生產(chǎn)重組膚的情況下，在培養(yǎng)結(jié) 束后通過利用離屯、分離、過濾等一般的分離方法對培養(yǎng)細(xì)胞和含有被分泌生產(chǎn)的膚的上清 進(jìn)行分離，從而可回收所生產(chǎn)的重組膚。另外，蓄積在培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)（包括周質(zhì)區(qū)域內(nèi)）的情況 下，例如，也可利用離屯、分離、過濾等方法從培養(yǎng)液中提取菌體，接著利用超聲波破碎法、壓 碎法等使該菌體破碎、和/或通過添加表面活性劑等進(jìn)行可溶化從而回收在細(xì)胞內(nèi)被蓄積 生產(chǎn)的膚。
[0104] 本發(fā)明的膚的純化可通過單獨使用或適宜組合親和色譜法、陽離子或陰離子交換 色譜法、凝膠過濾層析等進(jìn)行。確認(rèn)得到的純化物質(zhì)為目標(biāo)膚可通過一般的方法，例如SDS 聚丙締酷胺凝膠電泳、N末端氨基酸序列分析、免疫印跡等進(jìn)行。
[0105] 本申請主張了基于2013年8月30日申請的日本國專利申請第2013-180249號的優(yōu) 先權(quán)的利益。2013年8月30日申請的日本國專利申請第2013-180249號的說明書的全部內(nèi)容 作為參考引用到本申請中。
[0106] 實施例
[0107] 下面基于實施例詳細(xì)地說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不限定于運些實施例。
[0108] 在下述的實施例中取得的突變膚用"結(jié)構(gòu)域-導(dǎo)入后的突變"的形式進(jìn)行標(biāo)記，沒 有導(dǎo)入突變的野生型用"結(jié)構(gòu)域-Wild"的形式進(jìn)行標(biāo)記。例如，由序列號1所示的野生型SpG 的m結(jié)構(gòu)域標(biāo)記為巧l-WilcT，導(dǎo)入了突變K13T的SpG-化結(jié)構(gòu)域突變體標(biāo)記為巧1-K13r。
[0109] 對于同時導(dǎo)入了兩種突變的突變體的標(biāo)記而言，使用斜線一并進(jìn)行記載。例如，導(dǎo) 入了突變K13T和E19I的SpG-化結(jié)構(gòu)域突變體標(biāo)記為巧1-Κ13Τ/Ε1%~。
[0110] 另外，對于連接了多個單結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)而言，在句點所連接的數(shù)后附加"d"-并 進(jìn)行記載。例如，連接了 2個導(dǎo)入了突變K13T和E19I后的Sp地1結(jié)構(gòu)域突變體的蛋白質(zhì)標(biāo)記 為巧l-K13T/E19I.2(f。
[0111] 而且，例如，為了將蛋白質(zhì)固定化于水不溶性基材中，在C末端導(dǎo)入了具有固定化 用官能團(tuán)的切S殘基(C)時，在"d"后面賦予導(dǎo)入的氨基酸的1個字符標(biāo)記。例如，連接2個導(dǎo) 入了突變K13T和E19I后的SpGPl結(jié)構(gòu)域突變體并在C末端賦予Cys的蛋白質(zhì)標(biāo)記為"β1-K13T/E19I.2dC'。
[0112] 實施例1:各種SpG-化突變體的制備
[0113] (1)各種SpG-化突變體的表達(dá)質(zhì)粒制備
[0114] 關(guān)于表達(dá)質(zhì)粒的制備方法，將野生型SpG-βΙ作為例子示出。從野生型SpG-βΙ (序列 號1)的氨基酸序列起進(jìn)行逆翻譯，從而設(shè)計了編碼該膚的堿基序列（序列號3)。接著，將表 達(dá)質(zhì)粒的制作方法示于圖1。編碼野生型SpG-βΙ的DNAW連接具有相同限制酶位點的兩種雙 鏈DNA(n和f2)的方式進(jìn)行制備，引入表達(dá)載體的多克隆位點中。實際上，通過連接兩種雙 鏈DNA和表達(dá)載體的Ξ種雙鏈DNA的Ξ片段連接，同時實施了編碼DNA的制備和載體的引入。 兩種雙鏈DNA的制備方法是通過重疊 PCR對彼此含有30堿基左右的互補(bǔ)區(qū)的兩種單鏈寡DNA (f!-l/n-2或?2-?Λ·2-2)進(jìn)行延伸，從而制備了目標(biāo)雙鏈DNA。對于具體的實驗操作而言， 如下所述。通過外部訂購合成單鏈寡DNAf?-l(序列號4Vfl-2(序列號5)(SigmaGenosys公 司），作為聚合酶使用Pyrobest(Takara ΒΙ0公司），從而進(jìn)行了重疊 PCR反應(yīng)。對PCR反應(yīng)產(chǎn) 物進(jìn)行瓊脂糖電泳，將通過切出目標(biāo)條帶而提取的雙鏈DNA利用限制酶BamH巧此co52I(均