為化kara BI0公司）進(jìn)行切割。相同地，通過(guò)外部訂購(gòu)合成單鏈寡DNAf2-l(序列號(hào)6Vf2-2 (序列號(hào)7)，經(jīng)過(guò)重疊 PCR反應(yīng)，利用限制酶Eco52巧蛇CORK均為化kara BIO公司）切割所合 成?提取的雙鏈DNA。接著，在質(zhì)粒載體pGEX-6P-l(GE肥ALT肥ARE BI0SCIENCE公司）的多 克隆位點(diǎn)中的BamHI/EcoRI位點(diǎn)對(duì)上述兩種雙鏈DNA進(jìn)行了亞克隆。亞克隆中的連接反應(yīng)使 用Ligation higMTOYOBO公司），根據(jù)產(chǎn)品所附帶的流程為準(zhǔn)進(jìn)行了實(shí)施。
[0115] 使用上述質(zhì)粒載體PGEX-6P-1，根據(jù)在本感受態(tài)細(xì)胞產(chǎn)品附帶的流程進(jìn)行了感受 態(tài)細(xì)胞(Takara BI0公司，"大腸菌皿10Γ )的轉(zhuǎn)化。若使用上述質(zhì)粒載體PGEX-6P-1，則可產(chǎn) 生融合了谷脫甘膚-S-轉(zhuǎn)移酶下簡(jiǎn)稱為"GST")的SpG-m。接著，使用質(zhì)粒純化試劑盒 (Promega公司制，"Wizard Plus SV Minipreps DNA 化rification System"),根據(jù)試劑盒 附帶的標(biāo)準(zhǔn)流程，擴(kuò)增并提取了質(zhì)粒DM。對(duì)于表達(dá)質(zhì)粒的編碼DNA的堿基序列的確認(rèn)，使用 DNA測(cè)序儀(A卵lied Biosystems公司制，"3130x1 Genetic Analyzer")進(jìn)行。使用基因解 析試齊リ盒（Applied Biosystems 公司審 ij，''Bi 邑 Dye Terminator v.l.lCycle Sequencing Kit")和質(zhì)粒載體PGEX-6P-1的測(cè)序用DNA引物（GE肥ALTHCARE BIOSCIENCE公司），根據(jù)附 帶的流程進(jìn)行了測(cè)序PCR反應(yīng)。使用質(zhì)粒純化試劑盒(Applied Biosystems公司制，"BigDye XTerminator Purification Kit")，根據(jù)附帶的流程對(duì)該測(cè)序產(chǎn)物進(jìn)行純化，然后用于堿 基序列解析。
[0116] 關(guān)于編碼各種SpG-m突變體的DNA，從所期望的氨基酸序列進(jìn)行逆翻譯并設(shè)計(jì)編 碼該膚的堿基序列，用與上述相同的方法制備了含有編碼DNA的表達(dá)質(zhì)粒和轉(zhuǎn)化細(xì)胞。目前 通過(guò)外部訂購(gòu)可對(duì)200堿基左右的DNA(可編碼60殘基左右的蛋白質(zhì)）進(jìn)行全合成（例如， 化rogentec公司）。因此，W對(duì)應(yīng)所編碼的突變體的氨基酸序列的方式在后述的表中附上序 列號(hào)后，序列表中僅記載了所得到的最終的編碼DNA序列。
[0117] 關(guān)于2結(jié)構(gòu)域類型表達(dá)質(zhì)粒，將野生型SpG-βΙ作為例子示出制備方法。將所制備的 單結(jié)構(gòu)域類型SpG-m的表達(dá)質(zhì)粒的編碼DNA部分作為模板，使用在5'側(cè)賦予了BamH I識(shí)別 位點(diǎn)的引物(序列號(hào)8)和在3'側(cè)賦予了化nd III識(shí)別位點(diǎn)的引物(序列號(hào)9)進(jìn)行PCR反應(yīng)， 合成了雙鏈DNA(f-N)。相同地，使用在5'側(cè)賦予了 Hindlll識(shí)別位點(diǎn)的引物(序列號(hào)10)和在 3'側(cè)賦予了 EcoRI識(shí)別位點(diǎn)的引物(序列號(hào)11)進(jìn)行PCR反應(yīng)，合成了雙鏈DNA(f-C)。需要說(shuō) 明的是，對(duì)于在10位導(dǎo)入突變的SpG-m突變體，使用了在5 '側(cè)賦予了化ndn I識(shí)別位點(diǎn)的其 他引物(序列號(hào)12) dPCR反應(yīng)的聚合酶使用K0D-Plus-(T0Y0B0社），對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖 電泳，提取了目標(biāo)雙鏈DNAef-N通過(guò)限制酶BamHI/Hindlll進(jìn)行切割，f-C通過(guò)Hindlll/ EcoRI進(jìn)行切割，質(zhì)粒載體PGEX-6P-1通過(guò)限制酶BamHI/EcoRI進(jìn)行切割，通過(guò)與前述相同的 方法的Ξ片段連接制備了表達(dá)質(zhì)粒。其后的轉(zhuǎn)化和堿基序列確認(rèn)通過(guò)與前述相同的方法實(shí) 施。各種2結(jié)構(gòu)域類型的SpG-化突變體的表達(dá)質(zhì)粒通過(guò)相同的方法進(jìn)行制備。
[0118] (2)各種SpG-化突變體的制備
[0119] 在含氨節(jié)西林的2 XYT培養(yǎng)基中將上述（1)中得到的導(dǎo)入了各種SpG-m突變體基 因的各轉(zhuǎn)化細(xì)胞，在37°C下進(jìn)行整夜培養(yǎng)。將運(yùn)些培養(yǎng)液接種于含100倍量左右的氨節(jié)西林 的2XYT培養(yǎng)基中，在37°C下培養(yǎng)約2小時(shí)后，W最終濃度為O.lmM的方式添加 IPTG(異丙基-1-硫代-β-D-化喃半乳糖巧)并在37°C下培養(yǎng)了 18小時(shí)。
[0120] 培養(yǎng)結(jié)束后，通過(guò)離屯、進(jìn)行集菌，重懸于5mL PBS緩沖液中。通過(guò)超聲波破碎使細(xì) 胞破碎，進(jìn)行離屯、分離而分離出上清組分(無(wú)細(xì)胞提取液)和不溶性組分。在PGEX-6P-1載體 的多克隆位點(diǎn)導(dǎo)入目標(biāo)基因后，在N末端賦予了 GST的融合膚被表達(dá)。利用SDS電泳對(duì)各個(gè)組 分進(jìn)行分析的結(jié)果是，對(duì)于所有的從各個(gè)轉(zhuǎn)化細(xì)胞培養(yǎng)液制備的各種無(wú)細(xì)胞提取液，在分 子量約25000W上的位置確認(rèn)到了可認(rèn)為是被IPTG誘導(dǎo)的膚的條帶。需要說(shuō)明的是，分子量 幾乎相同，但由于突變體的種類不同而條帶的位置也不同。
[0121] 通過(guò)使用了對(duì)GST具有親和性的GSTrap FF層析柱(GE肥ALT肥ARE BI0SCIENCE公 司）的親和色譜法，從含有GST融合膚的各個(gè)無(wú)細(xì)胞提取液中粗純化了 GST融合膚。將各個(gè)無(wú) 細(xì)胞提取液添加至GSTrap FF層析柱，利用標(biāo)準(zhǔn)緩沖液（20mM化出P〇4-化2冊(cè)〇4,150mM 化Cl，pH7.4)清洗層析柱，接著通過(guò)洗脫用緩沖液(50mM Tris-HCl，20mM谷脫甘膚，P冊(cè).0) 洗脫了目標(biāo)GST融合膚。在之后的實(shí)施例中，W融合GST的形式直接用于分析的樣品，使用作 為離屯、式過(guò)濾器的Amicon(Merck Millipore公司），使用了 W濃縮的形式將該洗脫液置換 為標(biāo)準(zhǔn)緩沖液的膚溶液。
[012引在PGEX-6P- 1載體的多克隆位點(diǎn)導(dǎo)入基因后，能夠用序列特異的蛋白酶 PreScission Protease(GE HEALTHCARE BI0SCIENCE公司）切割GST的氨基酸序列被導(dǎo)入至 GST與目標(biāo)蛋白質(zhì)之間。使用Pr e Sc i S S i on Pro tease，按照附帶的流程進(jìn)行了 GST切割反應(yīng)。 通過(guò)使用Superdex 75 10/300化層析柱(GE肥ALT肥ARE BI0SCIENCE公司）的凝膠過(guò)濾色 譜法，從W運(yùn)種切割GST的方式用于分析的樣品中進(jìn)行了目標(biāo)膚的純化。將各個(gè)反應(yīng)溶液添 加至通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)緩沖液進(jìn)行了平衡化的Superdex 75 10/300化層析柱中，從切割后的GST、 PreScission Protease中分離純化了目標(biāo)蛋白質(zhì)。對(duì)于分子量與GST接近的2結(jié)構(gòu)域類型的 SpG-βΙ突變體而言，用相同的方法再用色譜法對(duì)洗脫組分進(jìn)行分離純化。需要說(shuō)明的是，通 過(guò)使用了 W上層析柱的色譜法進(jìn)行的膚純化全部利用AKTAprime plus系統(tǒng)（GE HEALTHCARE BIOSCIENCE社)進(jìn)行實(shí)施。另外，關(guān)于本實(shí)施例中得到的GST切割后的各個(gè)蛋白 質(zhì)，在N末端側(cè)附加了來(lái)自載體PGEX-6P-1的Gly-Pro-Leu-Gly-Se的序列。
[0123] 實(shí)施例2
[0124] (1)來(lái)自 IgG的Fab段（IgG-Fab)的制備
[0125] 將人源化單克隆IgG制劑作為原料，通過(guò)木瓜蛋白酶將其片段化為化b片段和Fc片 段，而僅對(duì)化b片段進(jìn)行了分離純化來(lái)制備。在此，示出了來(lái)自抗化r2單克隆抗體(通用名 "曲妥珠單抗"，Trastuzumab)的IgG-hb的制備方法，基本上其他的IgG-hb，例如來(lái)自抗 TN陽(yáng)單克隆抗體(通用名"阿達(dá)木單抗"，ada 1 imumab)的I gG-Fab也用相同的方法來(lái)制備。
[0126] 具體而言，將人源化單克隆IgG制劑（抗Her2單克隆抗體的情況下，Chugai 化armaceutical Co.，Ltd.制的"赫賽汀化erceptin)")溶解于木瓜蛋白酶消化用緩沖液 (0.1M Ac0H-Ac0Na，2mM 抓TA，lmM半脫氨酸，P冊(cè).5)中，添加化pain Agarose from papaya latex木瓜蛋白酶固定化瓊脂糖（SIGMA公司），一邊用旋轉(zhuǎn)器進(jìn)行混和，一邊在37°C下解育 約8小時(shí)。通過(guò)使用了 KanCapA層析柱化aneka公司）的親和色譜法，從由木瓜蛋白酶固定化 瓊脂糖中分離的反應(yīng)溶液(Fab片段和化片段混合存在）中，通過(guò)W流出組分的形式來(lái)回收 IgG-Fab進(jìn)行分離純化。通過(guò)使用了Superdex 75 10/300化層析柱(平衡化和分離中使用標(biāo) 準(zhǔn)緩沖液）的凝膠過(guò)濾色譜法對(duì)分取后的IgG-Fab溶液進(jìn)行純化，得到了 IgG-Fab溶液。需要 說(shuō)明的是，與實(shí)施例1(1)相同地，利用色譜法的蛋白質(zhì)純化利用AKTAprime plus系統(tǒng)來(lái)實(shí) 施。
[0127] (2)對(duì)各種SpG-化突變體的IgG-Fab的親和性的解析
[0128] 使用利用了表面等離子共振的生物傳感器Biacore3000(GE HEALTHCARE BIOSCIENCE公司），對(duì)在實(shí)施例1(2)中取得的各種SpG-βΙ突變體與IgG-Fab的親和性進(jìn)行解 析。本實(shí)施例中，將在實(shí)施例2(1)中取得的IgG-化b固定化在傳感器忍片上，將各種膚流至 忍片上，檢測(cè)了兩者的相互作用。通過(guò)使用了 N-徑基班巧酷亞胺(NHS)和N-乙基-N'-(3-二 甲氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽巧DC)的胺禪聯(lián)法將IgG-Fab固定化在傳感器忍片CM5,使用了 乙醇胺來(lái)進(jìn)行封閉（blocking)(傳感器忍片、固定化用試劑全部為GE化althcare Bio-Sc i ence s公司制）。I gG-Fab溶液使用固定化用緩沖液（1 OmM CHsCOOH-OfeCOONa，pH4.5)稀釋 至10倍左右，根據(jù)Biacore 3000附帶的流程，固定于傳感器忍片。另外，對(duì)于忍片上的其他 流動(dòng)池，在利用抓C/NHS進(jìn)行活化后，通過(guò)對(duì)乙醇胺固定化而進(jìn)行處理，從而也準(zhǔn)備了成為 陰性對(duì)照的參照池。各種SpG-β 1突變體使用運(yùn)行緩沖液（20mM化H2PO4-化2冊(cè)〇4，150mM NaCl，0.005%P-20，pH7.4)，在0.1~100μΜ的范圍內(nèi)適宜制備，W流速AOiiL/min將各個(gè)膚溶 液添加至傳感器忍片上60秒鐘。在測(cè)定溫度25°C下，依次觀測(cè)了添加時(shí)(結(jié)合相，60秒鐘）和 添加結(jié)束后(解離相，60秒鐘）的結(jié)合反應(yīng)曲線。在各個(gè)觀測(cè)結(jié)束后，添加20mM Na0H(30秒 鐘)并再生了傳感器忍片。該操作的目的是去除傳感器忍片上殘留的添加膚，確認(rèn)固定化的 人IgG的結(jié)合活性幾乎完全恢復(fù)。對(duì)得到的結(jié)合反應(yīng)曲線(減去參照池的結(jié)合反應(yīng)曲線的結(jié) 合反應(yīng)曲線），利用使用了系統(tǒng)附屬軟件ΒΙΑ evaluation的1:1的結(jié)合模型進(jìn)行擬合分析， 計(jì)算出了對(duì)于人IgG的親和常數(shù)化4=心。/心::）。將結(jié)果示于表1。
[0129] [表 1]
[0130]
[0131] 如表1示出的結(jié)果所述，確認(rèn)了本發(fā)明中得到的突變體與野生型相比，與IgG-Fab 的結(jié)合常數(shù)提高了，即與IgG-Fab的結(jié)合力增強(qiáng)。另外，由于對(duì)兩種IgG-Fab的結(jié)合力提高的