融合鐵蛋白在疫苗和其他方面的應用
【專利說明】融合鐵蛋白在疫苗和其他方面的應用
[00011 本申請是2003年5月12日遞交的申請?zhí)枮?3813504.3，發(fā)明名稱為"融合鐵蛋白在 疫苗和其他方面的應用"的分案申請。
[0002] 相關申請
[0003] 本專利申請擁有60，379，145號美國臨時專利的權益，60，379，145號臨時專利申請 于2002年5月10日提交，該專利申請的全文在此通過引證被并入本文。 發(fā)明領域
[0004] 本發(fā)明通常涉及融合鐵蛋白，特別是在鐵蛋白內(nèi)部和外部的N端和/或C端融合其 他蛋白或肽片段形成能夠自組裝的融合蛋白，以及該類融合蛋白在作為疫苗和其他方面的 應用，包括運輸氧氣以及治療性導入藥物和其他治療藥劑。
[0005] 發(fā)明背景
[0006] 鐵蛋白含有高度保守的24個亞基，這些亞基存在于所有的動物、細菌和植物中。鐵 蛋白的主要生理作用是控制多核Fe(III) 203形成的速度和定位。（見Theil，E.C.等人在 《Adv · Enzymol · Re lat .Areas Mo l.Biol·》上發(fā)表的文章，1990,63:421-449 ; Harrison， Ρ·Μ·，Lilley，T.H.等人在Loehr Τ·Μ·編著的《Weinheim:VCH》中的文章，1990,33-452)該控 制作用是通過生物礦化作用，將水合鐵離子和質(zhì)子運進和運出含無機物的內(nèi)核實現(xiàn)的。通 過這一機制使鐵蛋白積累的鐵離子強度大于生理狀態(tài)下可溶性的游離鐵離子強度。生物礦 化作用的速度直接與每個鐵蛋白顆粒內(nèi)的Η亞基和L亞基（即所謂的輕鏈和重鏈)的比例相 關，Η亞基含量增加時表現(xiàn)出鐵離子儲存速度增加的趨勢。蛋白顆粒的組成差異具有組織特 異性，并影響鐵的氧化代謝、核心形成和鐵循環(huán)的機制。比如，血清中的鐵蛋白主要由L鏈組 成，來自于心臟的鐵蛋白Η鏈含量較高。鐵蛋白礦化核心為不同的氧化酶提供鐵離子，而且 起到還原的作用。
[0007] 每個鐵蛋白由24個亞基組成，每個亞基含有432個對稱體，直徑125埃，顆粒厚度約 為25埃，中空的內(nèi)部核心直徑約為80埃(圖1)。典型的鐵蛋白單體含有至少兩個異構體，由Η 鏈和L鏈組成，二者在氨基酸序列上不同。在許多脊椎動物包括人中已經(jīng)確定Η亞基和L亞基 的長度，這兩種結構體通常存在于已經(jīng)確證的鐵蛋白中。每個鐵蛋白亞基分子量大約為17 道爾頓，具有束狀螺旋的拓撲結構，包含4個反向平行螺旋基序和一個短螺旋(C端螺旋），該 螺旋大致與第4個束狀螺旋的長軸垂直。依據(jù)慣例從Ν端開始分別將螺旋標記為"A，Β，C，D和 Ε" Α端序列與顆粒第3個折疊軸相鄰并明顯延伸到顆粒表面，而Ε螺旋與第4個折疊軸擠壓 在一起，其C端延伸到顆粒核心。擠壓的結果是在蛋白顆粒表面形成2個孔。位于第四個折疊 的孔大約有4-5埃，主要為疏水性;而位于第三個折疊的孔直徑略大，是6.0埃，主要為親水 性。這兩個孔或其中一個可能是水合鐵離子擴散出入顆粒的通道。
[0008] 以前關于鐵蛋白的研究工作，如5，248，589; 5，358，722和5，304，382號美國專利， 通過引證被并入本文均列在參考文獻中，主要集中在蛋白外殼和內(nèi)核的生理作用方面，如 除了含鐵水合物以外的物質(zhì)可能定位于殼內(nèi)。通過差示掃描量熱法研究顯示（見SP Martsev，AP Vlasov，P Arosio,等人在《Proterin Engineering》發(fā)表的文章，1998，11， 377-381)重組人L和Η鐵蛋白在pH2.0到2.8之間時解離成亞基單體。
[0009]其他方面的工作包括使用病毒樣顆粒作為疫苗的結構模型，在缺少佐劑的的情況 下誘導產(chǎn)生抗體反應，保護免受病毒感染和過敏反應(見Lechner等人在《Intervirology》 發(fā)表的文章，2002,212-217,45(4-6))，但該系統(tǒng)不包括以鐵蛋白為基礎的蛋白開發(fā)系統(tǒng)。 在Marchenko等人在2003年《J.Mol .Microbiol Biotechnol》5(2) :97-104頁發(fā)表的文章中， 已知蛋白P1-380能夠形成病毒樣顆粒(VLP)。在該研究中，P1-380蛋白的C端和/或N端融合 后不影響VLP的自組裝，具有雙功能的融合蛋白顆粒顯示出誘導更強免疫反應的能力。 Douglas等人還進行了以下研究:一種形成鐵離子核的蛋白與豇豆花葉病毒(CCMV)相連，具 體參考發(fā)表在《Adv.Mater.》上的文章，2002,14(6)，415-418頁。其他的融合蛋白還有包含 與乳頭瘤病毒非結構蛋白L2,一種次要結構蛋白，融合形成的病毒樣顆粒的嵌合蛋白，具體 參考Greenstone等人在《PNAS USA》上發(fā)表的文章，1998，95(4)，1800-1805頁。但是以上所 有的融合蛋白中都不包括鐵蛋白。
[0010]因此，以前的文獻均未對鐵蛋白的使用或分別對顆粒外表面和內(nèi)表面的N端和C端 的任何用途進行過研究（如圖2A和B顯示），而且也沒有人利用該結構通過與鐵蛋白融合連 接其他蛋白或肽以加強這些蛋白或肽的特性，產(chǎn)生能夠自組裝的的融合蛋白。
[0011] 發(fā)明簡述
[0012] 因此，本發(fā)明的目標是提供包括與鐵蛋白N端和/或C端融合的蛋白或肽片段的融 合鐵蛋白。
[0013] 本發(fā)明的另一目標是除了提供融合鐵蛋白，還提供一種表達蛋白的方法，表達蛋 白既可以與顆粒表面結合，也可以通過任一蛋白末端的延伸的內(nèi)在化表達。
[0014] 本發(fā)明的又一目標是提供融合蛋白產(chǎn)品，可應用于疫苗、治療、圖象襯比試劑、新 的金屬鰲合系統(tǒng)、膠凝劑、蛋白純化平臺、治療性受體結合蛋白和其他適當?shù)膽谩?br>[0015] 本發(fā)明的再一目標是提供可以在醫(yī)人和醫(yī)獸中應用及其他許多非治療方面中應 用的融合鐵蛋白。
[0016] 本發(fā)明的另一目標是提供能延長動脈停留時間的融合鐵蛋白，這樣可以促進免疫 反應的發(fā)生，使藥物和其他治療藥劑發(fā)揮更長時間的治療作用。
[0017] 本發(fā)明的其它目標是提供重組融合鐵蛋白在疫苗、藥物導入和其他許多治療方面 的應用，重組融合鐵蛋白包括能融合到鐵蛋白上的蛋白和肽且不影響蛋白的自組裝或形成 高級聚合結構的能力如形成顆粒結構或聚合體的片段。
[0018] 本發(fā)明的這些目標及其它目標是提供包含外源蛋白或肽的融合鐵蛋白，并能形成 聚合結構如鐵蛋白顆?；蚱渌酆象w，外源蛋白或肽與鐵蛋白N或C末端連接。所融合的外 源蛋白或肽不會限制融合蛋白形成具有功能的高級結構如顆粒結構，但也可能形成其他的 聚合結構如半球形，柱狀等。依照本發(fā)明，融合鐵蛋白提供了一種表達蛋白的方法，可以與 鐵蛋白外部如顆粒表面連接，或通過蛋白末端延伸融合表達在蛋白內(nèi)部。本發(fā)明的融合蛋 白有多種形式，病毒包膜和衣殼蛋白與鐵蛋白融合可以作為病毒疫苗使用。此外因為本發(fā) 明的方法還可以融合表達多種蛋白和肽，可以構建多價融合蛋白，如來自同一生物體的不 同蛋白或來自不同生物體的相同蛋白作為多價疫苗。
[0019] 此外，形成鐵蛋白顆粒結構時，C端位于鐵蛋白內(nèi)部核心位置，N端位于蛋白外表 面，因此可以構建這樣的疫苗:與鐵蛋白表面連接的第一種蛋白或肽抗原能快速誘導產(chǎn)生 抗體，而第二種所需抗原與內(nèi)部C端連接，從而在開始的免疫反應中受到屏蔽達到延長反應 時間的目的。因此該類疫苗的第一部分能誘導產(chǎn)生最初的抗體，疫苗的第二部分只有在經(jīng) 過一定時間后降解與鐵蛋白核心解離暴露第二種抗原才具有免疫原性。這種內(nèi)部屏蔽作用 為導入非水溶性抗原提供了方法。而且，因為與鐵蛋白連接，還能增強融合蛋白或肽在降解 前的有效作用時間，有利于治療性蛋白或肽發(fā)揮作用。本發(fā)明中融合蛋白的其他優(yōu)點還有 當不希望偶聯(lián)表達的多肽或蛋白引起免疫反應時可以使用人源顆粒(或在獸醫(yī)中使用動物 來源的顆粒)避免產(chǎn)生免疫相關問題。另一個應用是使用鐵蛋白顆粒組裝人血紅蛋白聚合 體作為運輸血液中氧的替代品。最后這類融合蛋白在其他方面也有作用，如清除金屬，包裹 有用的蛋白或小分子，或儲存與抗體相連、針對特定組織或細胞的具有放射活性的物質(zhì)。
[0020] 對于讀過本說明書和/或引入本文作為參考的此領域的普通技術人員來說，在本 發(fā)明的公開范圍內(nèi)的實施方案和其選擇方案和修改是顯而易見的，所有這樣的方案引入本 文作為參考。
[0021] 圖示簡介
[0022]圖1是鐵蛋白顆粒的連續(xù)剖面圖，從四個折疊軸（中心）的角度觀察，亞基以醒目的 顏色表示。
[0023]圖2A-2B顯示鐵蛋白顆粒下部四個折疊軸（中心）的1/3圖形立體圖.清晰標出外部 N端和內(nèi)部C端，說明可以利用末端構建重組融合蛋白或肽。圖2A顯示顆粒內(nèi)部的結構，圖2B 顯示外表面結構。
[0024]圖3為質(zhì)粒示意圖，質(zhì)粒編碼根據(jù)本發(fā)明構建的人血紅蛋白α鏈與人鐵蛋白C端融 合的蛋白。
[0025]圖4為在第四個折疊軸周圍組裝的亞基立體結構圖。箭頭所示是亞基假定的旋轉 方向，通過旋轉可容納較大的C端融合蛋白。
[0026] 圖5為(Fl.G.Hq)的正則直方圖。
[0027]圖6為馬心臟天然鐵蛋白的正則直方圖。
[0028] 圖7為(FL.GG.Ag4)的正則直方圖。
[0029]圖8為(Fl . GG. Ag4)特有顆粒構像的透射電鏡圖，顯示(FL. GG. Ag4)顆粒特有構想 的透射電鏡圖，M.Stone，et al.未發(fā)表結果。
[0030] 圖9為質(zhì)粒示意圖，質(zhì)粒編碼根據(jù)本發(fā)明構建的HIV Tat