蛋白（84個氨基酸）與人鐵 蛋白N端連接的融合蛋白。
[0031] 圖10為使用針對Tat的多克隆抗體進(jìn)行的免疫印跡分析圖，確證了本發(fā)明中鐵蛋 白-Tat蛋白成功構(gòu)建。
[0032] 圖11為(Ta t · 6G · Fl )的正則直方圖。
[0033]圖12A為質(zhì)粒示意圖，質(zhì)粒編碼根據(jù)本發(fā)明構(gòu)建的HIV Tat小肽與人鐵蛋白輕鏈N 端連接的融合蛋白。
[0034]圖12B為質(zhì)粒示意圖，質(zhì)粒編碼根據(jù)本發(fā)明構(gòu)建的HIV P24蛋白與人鐵蛋白輕鏈N 端連接的融合蛋白。
[0035]本發(fā)明的詳細(xì)描述
[0036]根據(jù)本發(fā)明，融合鐵蛋白是指至少在鐵蛋白的一個鏈如Η或L鏈融合有外源蛋白， 這些蛋白或肽能夠與鐵蛋白的Ν端或C端結(jié)合且不影響融合蛋白形成聚合結(jié)構(gòu)如顆粒、聚合 體或其他功能性結(jié)構(gòu)的能力。鐵蛋白含有高度保守的24個蛋白亞基，這些亞基存在于所有 動物、細(xì)菌和植物中，主要作用是通過從礦化核心運(yùn)進(jìn)和運(yùn)出水合鐵離子和質(zhì)子來控制多 核Fe(III) 2〇3形成的速度和定位。通過這一機(jī)制，鐵蛋白積累了一定濃度的鐵離子，其濃度 在生理狀態(tài)下高于可溶性游離鐵離子。生物礦物化作用的速度直接與鐵蛋白顆粒內(nèi)的Η亞 基和L亞基（即所謂的輕鏈和重鏈)的比例相關(guān)，隨著Η鏈含量增高其儲存鐵的速度也隨著增 高。這種顆粒組成的差異具有組織特異性，影響鐵的氧化，核心形成和鐵的運(yùn)轉(zhuǎn)。鐵蛋白的 礦物化核心能夠?yàn)樵S多氧化還原酶提供具有生物活性的鐵離子，還具有解毒作用。
[0037]每個鐵蛋白由24個亞基組成顆粒，每個顆粒含432個對稱體，直徑為125埃，外殼厚 度約為25埃，中空的內(nèi)部核心直徑約為80埃（圖1)。典型的鐵蛋白單體結(jié)構(gòu)至少有含有Η鏈 和L鏈的兩種異構(gòu)體，這兩種鏈的差異在于氨基酸序列的不同。在包括人的脊椎動物中發(fā)現(xiàn) 了多種長度的Η亞基和L亞基。每個鐵蛋白亞基的分子量約為17Κ d，具有束狀螺旋的拓?fù)浣Y(jié) 構(gòu)，包括4個反平行螺旋基序和一個短螺旋(C端螺旋），該短螺旋與第4個螺旋束的長軸大致 垂直。依據(jù)慣例從N端開始分別將螺旋標(biāo)記為"A，B，C，D和E" A端序列與顆粒的第3個折疊軸 相鄰，延伸到蛋白表面，而E螺旋在第4個折疊軸擠壓在一起，其C端延伸到顆粒核心。螺旋擠 壓在顆粒表面形成兩個小孔。位于第4折疊區(qū)的小孔約有4-5埃，主要為疏水性。位于第3折 疊區(qū)的小孔稍大些，直徑約有6.0埃，主要為親水性。這兩個孔或其中一個可能是水合鐵離 子擴(kuò)散出入顆粒的通道。
[0038] 根據(jù)本發(fā)明，可以將適當(dāng)?shù)牡鞍谆螂娜诤系借F蛋白的N端，緊鄰蛋白顆粒的第三個 折疊軸形成顆粒外產(chǎn)物;或者將蛋白或肽融合到C端，延伸到蛋白核心形成顆粒內(nèi)產(chǎn)物，或 者是以上二者的集合體。這里所說的鐵蛋白是指鐵蛋白和/或它的Η鏈和/或L鏈以及鐵蛋白 類似物如5，304，382號美國專利中所描述的，在此通過引證被并入本文，還包括去鐵鐵蛋白 和那些具有鐵蛋白結(jié)構(gòu)的蛋白，即蛋白外表面為Ν端區(qū)域，內(nèi)部核心為C端區(qū)域。本發(fā)明使用 的蛋白或肽包括那些氨基酸序列能與鐵蛋白連接但不影響其結(jié)構(gòu)的蛋白、多肽、抗體、片 斷、酶、半抗原、肽聚糖或其他分子。融合鐵蛋白表達(dá)后自組裝成大分子或聚合結(jié)構(gòu)，與天然 鐵蛋白具有相同的構(gòu)和構(gòu)像(Ν端在表面，C端在內(nèi)部核心）。
[0039] 根據(jù)本發(fā)明設(shè)計(jì)融合產(chǎn)物時，有必要考慮在每個鐵蛋白和與鐵蛋白融合的蛋白或 肽之間包括"間隔"結(jié)構(gòu)的殘基，如甘氨酸或其他適當(dāng)?shù)陌被?。一般而言間隔結(jié)構(gòu)能增加 鐵蛋白中心與連接蛋白或肽之間的距離，如希望增加鐵蛋白與融合蛋白或肽之間的空間 時。鐵蛋白與具有抗原性的蛋白或肽連接時該類情況較多。因?yàn)槌浞直┞犊乖欣诋a(chǎn)生 抗體如在疫苗的使用中。此外，本發(fā)明的融合蛋白是抗體與鐵蛋白連接，間隔結(jié)構(gòu)能減少鐵 蛋白與融合蛋白之間的空間位阻，使抗體更好的與目標(biāo)結(jié)合。通常連接的分子越大就越需 要充足的間隔結(jié)構(gòu)。因此在本發(fā)明的融合產(chǎn)物中，無論是顆粒內(nèi)融合產(chǎn)物還是顆粒外融合 產(chǎn)物，如果顆粒外部需要足夠的空間容納較大蛋白時，均可利用一個或更多的甘氨酸殘基 (或其他適當(dāng)?shù)陌被幔?。通常選擇甘氨酸因?yàn)樗梢孕纬删哂袕椥缘?鏈"，容易適應(yīng)外伸 的多肽構(gòu)像。
[0040] 正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所認(rèn)識的一樣，根據(jù)生理或物理需要，當(dāng)需要屏蔽環(huán)境中的 滅活或其他造成蛋白降解或切除因素時，可以將目標(biāo)蛋白或肽融合到鐵蛋白內(nèi)部;不需要 屏蔽蛋白如希望引起更加快速的免疫反應(yīng)時目標(biāo)蛋白或肽可融合到蛋白外部。此外還可以 利用顆粒內(nèi)部(C端)或外部(Ν端)融合蛋白形成混合顆粒，如在顆粒表面或內(nèi)部表達(dá)多種抗 原蛋白或肽?？梢岳眠@個方法確保發(fā)生抗體反應(yīng)和細(xì)胞免疫反應(yīng)。另外可以利用相同方 法表達(dá)的多種酶為多步生化反應(yīng)產(chǎn)生高度濃縮的酶"工廠"。通過相同載體多重表達(dá)或使用 已知方法使顆粒解離后再與目的產(chǎn)物重新連接形成混合物的方法構(gòu)建這類多價嵌合鐵蛋 白。
[0041] 本發(fā)明利用N端和C端分別在聚合結(jié)構(gòu)外部和內(nèi)部的定位（圖2A和2B)，將蛋白或肽 連接到這些特定位置構(gòu)建融合蛋白。在優(yōu)選實(shí)施例中，使用適當(dāng)?shù)姆椒ㄖ苽浔景l(fā)明的融合 鐵蛋白，其中至少有一種蛋白或肽與鐵蛋白連接，且不會影響融合蛋白形成聚合結(jié)構(gòu)，即融 合鐵蛋白形成穩(wěn)定多聚體結(jié)構(gòu)時蛋白或肽仍與鐵蛋白保持連接，鐵蛋白保持基本的內(nèi)部核 心和外部表面結(jié)構(gòu)，外表面的N端或內(nèi)表面的C端與蛋白或肽連接(或在兩個部位都進(jìn)行連 接）。本發(fā)明的一個實(shí)施方案是融合蛋白具有鐵蛋白形成聚合顆粒結(jié)構(gòu)的特性。可以理解的 是，鐵蛋白具有自組裝的趨勢是有利的，表現(xiàn)出多種不同的形式，不僅是顆粒結(jié)構(gòu)，還有其 他的聚合結(jié)構(gòu)如聚合體、半球形、柱狀等結(jié)構(gòu)。根據(jù)本發(fā)明與鐵蛋白融合的自組裝產(chǎn)物具備 多種應(yīng)用：如疫苗和以下詳細(xì)描述的方面?？梢允褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員熟知的適當(dāng)方法構(gòu)建 本發(fā)明的融合蛋白，如重組表達(dá)或通過物理或化學(xué)方法與單個蛋白連接構(gòu)建本發(fā)明的融合 蛋白。
[0042] 根據(jù)本發(fā)明，融合鐵蛋白具有融合到外部如與外部N端連接的蛋白或通過與C端連 接表達(dá)在內(nèi)部的蛋白。正如下面詳細(xì)描述的一樣，本發(fā)明中融合蛋白的應(yīng)用領(lǐng)域包括:疫 苗、治療、圖象襯比試劑、新的金屬鰲合系統(tǒng)、膠凝劑、蛋白純化平臺、治療性受體結(jié)合蛋白 等，在人和獸醫(yī)中還有許多非治療方面的應(yīng)用。
[0043] 如上所述，使用基因工程領(lǐng)域常規(guī)的重組技術(shù)就能構(gòu)建本發(fā)明中重組表達(dá)的融合 鐵蛋白。如使用分子克隆的方法構(gòu)建融合蛋白，比如通過與適當(dāng)?shù)蔫F蛋白如人鐵蛋白L鏈連 接，在大腸桿菌中表達(dá)制備重組人血紅蛋白α亞基。在這一過程中，使用以PCR為基礎(chǔ)的方法 將血紅蛋白α亞基的全長cDNA與鐵蛋白輕鏈基因的C端通過甘氨酸連接子連接（圖3)?；?構(gòu)建完成后，進(jìn)行蛋白表達(dá)和分離和/或純化。首先對融合蛋白（如鐵蛋白/血紅蛋白融合蛋 白）的編碼序列測序以確保重組體具有正確的DNA序列。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化蛋白表達(dá)細(xì)菌BL21 (DE3)。當(dāng)細(xì)菌繁殖到合適濃度如0D值為1.0(600nm)時，加入ImM IPTG激活T7啟動子，在30 °〇誘導(dǎo)表達(dá)。表達(dá)結(jié)束后細(xì)菌重懸在B-PER緩沖液中進(jìn)行超聲破碎釋放蛋白。然后對融合蛋 白進(jìn)行分離和/或純化，如采用合適的層析方法或其他方法如分子排阻、凝膠過濾、離子交 換層析等從上清液中分離蛋白。使用適當(dāng)?shù)亩嗫寺『蛦慰寺】贵w通過常規(guī)的免疫印跡試驗(yàn) 進(jìn)行蛋白確證。
[0044] 本發(fā)明中的融合蛋白構(gòu)建完成后，通過下列觀察對顆粒構(gòu)像進(jìn)行確認(rèn)：
[0045] 1)分子排阻凝膠層析純化的表達(dá)產(chǎn)物具有與比天然重組鐵蛋白（鐵蛋白分子量， 408K)稍大的蛋白復(fù)合物一致的保留效應(yīng)；
[0046] 2)使用光度計(jì)檢測單個蛋白的分散性，顯示蛋白直徑約是天然鐵蛋白的兩倍（圖6 和表2);
[0047] 3)使用適當(dāng)?shù)亩嗫寺】贵w(如在上述實(shí)施例中，同時使用人鐵蛋白和血紅蛋白α的 多克隆抗體)與融合蛋白進(jìn)行免疫印跡試驗(yàn)，分別得到陽性結(jié)果。
[0048]根據(jù)本發(fā)明，融合蛋白中的亞基數(shù)目有可能顯著多于天然鐵蛋白中的24個亞基數(shù) 目，說明顆粒具有增加亞基與亞基之間組裝角度的能力，二聚體可能通過旋轉(zhuǎn)與平行于第 二個折疊軸的"B"螺旋組裝，位于顆粒表面"B-C環(huán)"的彈性使二聚體進(jìn)一步得到穩(wěn)定，B-C環(huán) 穿過第二個折疊軸形成反平行β折疊。該旋轉(zhuǎn)假說得到空間相互作用的支持，顆粒曲率增大 為較大的血紅蛋白分子提供更多空間。亞基組裝角度發(fā)生的較小變化與顆粒直徑的顯著增 加相關(guān)，使顆粒內(nèi)部能容納更大的融合產(chǎn)物。同時可以更好的理解通過對表面暴露的環(huán)、Β-C環(huán)進(jìn)行修飾或替換構(gòu)建"嵌合"鐵蛋白分子，用于疫苗或其他方面。
[0049] 因此可以利用本發(fā)明的融合蛋白增強(qiáng)多種治療性蛋白和肽的效果。特別是通過與 鐵蛋白連接極大增強(qiáng)了治療性蛋白在血漿中的半衰期，其半衰期通常為18-20個小時。因此 當(dāng)血液中的非融合蛋白或肽被完全降解后，融合蛋白或肽仍能提供較長時間的治療作用。 此外，蛋白或肽與鐵蛋白融合后可以避免免疫相關(guān)問題，特別是蛋白與鐵蛋白內(nèi)部C端區(qū)域 連接時。同樣，融合鐵蛋白能夠?qū)σ恍┑鞍谆螂?如酶，毒素鰲合物或小分子治療劑)起保護(hù) 作用，否則這些蛋白或肽在血液中很快被降解。在這類應(yīng)用中最好將這些蛋白和肽與鐵蛋 白C端區(qū)域連接，使它們位于融合蛋白顆粒的內(nèi)部核心部位。
[0050] 經(jīng)濟(jì)并可測量的分離純化融合鐵蛋白產(chǎn)物
[0051] 更進(jìn)一步，蛋白或小肽與鐵蛋白外部的酶切位點(diǎn)連接后，根據(jù)鐵蛋白顆粒大小的 差異，使用簡單的超濾對終產(chǎn)物進(jìn)行分離，然后通過酶切將融合產(chǎn)物容易的分離出來。因 此可以利用融合鐵蛋白平臺進(jìn)行方便經(jīng)濟(jì)的顆粒外融合產(chǎn)物的分離。
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