式。然而，根據(jù)本申請的公開內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)可認(rèn)識到對本 文公開的具體實施方案所做的各沒有背離本發(fā)明范圍和精神的并仍然獲得相同或相似結(jié) 果的修改。
[0075]例1顆粒內(nèi)表達(dá)的融合蛋白：
[0076] 人血紅蛋白蛋白α鏈通過單甘氨酸連接子與人鐵蛋白C端連接構(gòu)成重組融合蛋白 [0077]顆?？s寫：（FL.G.Ha)。
[0078] 分子克?。涸诖竽c桿菌中表達(dá)人血紅蛋白a亞基與人鐵蛋白L鏈融合的重組蛋白。 使用PCR方法將血紅蛋白a鏈的全長CDNA與鐵蛋白輕鏈基因C端通過由一個甘氨酸組成的 連接子連接(圖3)。
[0079] 蛋白表達(dá)和純化:通過DNA測序驗證鐵蛋白/血紅蛋白的編碼序列。將重組子轉(zhuǎn)化 蛋白表達(dá)細(xì)菌BL21(DE3)。轉(zhuǎn)化細(xì)菌生長到0D值為1.0(600nm)時，加入ImMIPTG激活T7啟動 子，在30度誘導(dǎo)表達(dá)。表達(dá)結(jié)束后將細(xì)胞重懸于B-PER緩沖液中，超聲破碎釋放蛋白。使用分 子篩和離子交換凝膠過濾層析從上清中純化重組的融合蛋白。使用多克隆和單克隆抗體進(jìn) 行免疫印跡試驗確證表達(dá)蛋白。
[0080] 通過以下觀察顯示顆?；蜃越M裝顆粒(SAP)具有正確構(gòu)像：
[0081] 1)分子排阻凝膠層析洗脫的純化表達(dá)產(chǎn)物具有與大于天然重組鐵蛋白一致的保 留效應(yīng)(鐵蛋白分子量:408K)。
[0082] 2)圖5和表1中的蛋白光掃描試驗顯示單個分散蛋白的直徑約是天然鐵蛋白2.5 倍，這一數(shù)據(jù)是根據(jù)圖6和表2中的數(shù)值(這些數(shù)值一般不十分準(zhǔn)確，但重要的是為單個分散 蛋白提供了分子大小一致和有序SAP的依據(jù))進(jìn)行估計的。分別使用針對人鐵蛋白和血紅蛋 白a的多克隆抗體與融合產(chǎn)物進(jìn)行免疫印跡試驗，應(yīng)得到陽性結(jié)果。
[0083]對本復(fù)合物使用光散射分析得到的亞基數(shù)目要高于天然鐵蛋白中的24個。盡管該 復(fù)合物的確切結(jié)構(gòu)還不清楚，SAP與單個分子在性質(zhì)上是一致的。說明亞基與亞基之間的結(jié) 合具有增加組裝角度的內(nèi)在能力。假設(shè)二聚體(見圖4)越過顆粒第二個折疊軸旋轉(zhuǎn)后與B螺 旋組裝，顆粒表面越過第二個折疊軸與β折疊反平行的B-C環(huán)的彈性進(jìn)一步穩(wěn)定了這種相互 作用。這一旋轉(zhuǎn)假設(shè)得到血紅蛋白a鏈之間的空間相互作用的支持，如彎曲率大的顆粒能 容納較大的血紅蛋白分子。這些亞基組裝角度中小的變化與顆粒直徑的增加有關(guān)，使得顆 粒核心能容納更大的融合蛋白。 「00841
[0085] 表l(FL.G.Ha)的數(shù)據(jù)表。在溫度22°C使用Proteinsolutions Dynapro光散射分光 光度計進(jìn)行檢測得到的結(jié)果。
[0086]
[0087] 表2(天然馬的心臟的鐵蛋白）的數(shù)據(jù)表。在溫度22°C使用Proteinsolutions Dynapro光散射分光光度計進(jìn)行檢測得到的結(jié)果。
[0088]例2顆粒內(nèi)表達(dá)的融合蛋白：
[0089] 銀濃縮多肽通過包含2個甘氨酸的連接子與人鐵蛋白L鏈C端連接構(gòu)成重組融合蛋 旦
[0090] 顆?？s寫：（FL.GG.Ag4)，AG4是指NPSSLFRYLPSD(序列號：1)。
[0091] 作為與鐵蛋白連接的金屬提取多肽，通過下列觀察顯示顆粒具有正確構(gòu)像：
[0092] 1)分子排阻凝膠層析洗脫的純化表達(dá)產(chǎn)物具有與天然重組鐵蛋白（鐵蛋白分子 量:408K) -致的保留效應(yīng)。
[0093] 2)圖7和表3中的蛋白光散射試驗顯示單個分散蛋白的直徑約為180埃；
[0094] 3)silver condensing peptide的顆粒特點已經(jīng)明確；
[0095] 4)透射電子顯微鏡成像顯示具有適當(dāng)外部尺寸的多面體顆粒與鐵蛋白X射線結(jié)構(gòu) 完全一致(圖8)。
[0096]
[0097] 表3(FL.GG.Ag4)的數(shù)據(jù)表。在溫度22°C使用Proteinsolutions Dynapro光散射分 光光度計進(jìn)行檢測得到的結(jié)果。
[0098]例3顆粒外融合蛋白
[0099] HIV Tat蛋白（84個氨基酸)通過包含6個甘氨酸的連接子與N端連接構(gòu)成重組蛋 白。
[0100]顆粒縮寫：（Tat.6G.FL)
[0101] 其中：
[0102] HIV Tat蛋白序列：
[0103] MEPVDPRLEP WKHPGSQPKT ACTNCYCKKC CFHCQVCFIT KALGISYGRK KRRQRRRAHQ NSQTHQASLS KQPTSQPRGD PTGPKE-(序列號：2)
[0104] 甘氨酸連接子序列：
[0105] GGGGGG(序列號：3)
[0106] 人鐵蛋白L鏈序列：
[0107] MSSQIRQNYS TDVEAAVNSL VNLYLQASYT YLSLGFYFDR DDVALEGVSH FFRELAEEKR EGYERLLKMQ NQRGGRALFQ DIKKPAEDEW GKTPDAMKAA MALEKKLNQA LLDLHALGSA RTDPHLCDFL ETHFLDEEVK LIKKMGDHLT NLHRLGGPEA GLGEYLFERL TLKHD(序列號：4)
[0108]分子克?。涸诖竽c桿菌中表達(dá)野生型HIV-lTat與人鐵蛋白L鏈融合的重組蛋白。使 用PCR方法將Tat蛋白的全長cDNA與鐵蛋白輕鏈基因N端通過包含6個甘氨酸的連接子連接 (圖 9)。
[0109] 蛋白表達(dá)和純化:通過DNA測序驗證鐵蛋白/Tat的編碼序列。將重組子轉(zhuǎn)化蛋白表 達(dá)細(xì)菌BL21(DE3)。轉(zhuǎn)化細(xì)菌生長到0D值為1.0(600nm)時，加入ImMIPTG激活T7啟動子，在 30度誘導(dǎo)表達(dá)。表達(dá)結(jié)束后將細(xì)胞重懸于B-PER緩沖液中，超聲破碎釋放蛋白。使用分子篩 和離子交換凝膠過濾層析從上清中純化重組的融合蛋白。使用多克隆和單克隆抗體進(jìn)行免 疫印跡試驗確證表達(dá)蛋白（圖10)。
[0110]通過下列觀察顯示顆粒具有正確構(gòu)像：
[0111] 1)分子排阻凝膠層析洗脫的純化表達(dá)產(chǎn)物具有與同樣大小或大于天然重組鐵蛋 白（鐵蛋白分子量:408K)特點一致的保留效應(yīng)，；
[0112] 2)圖11和表4中的蛋白光散射試驗顯示，單個分散蛋白的直徑約是天然鐵蛋白2 倍；
[0113] 3)使用針對Tat的多克隆抗體與融合蛋白進(jìn)行免疫印跡試驗得到陽性結(jié)果（圖 10)〇
[0114]表4(了31:.66.?1^)的數(shù)據(jù)表。在溫度為22°〇使用？1'(^6；[11801111:;[011807仙。1'0光散射 分光光度計進(jìn)行檢測得到的結(jié)果。
[0115]
[0116] 例4顆粒外融合蛋白
[0117] HIV Tat小肽通過包含6個甘氨酸的連接子與人鐵蛋白L鏈N端連接構(gòu)成重組蛋白。
[0118] 顆粒縮寫：（TatP. 6G.Fl)，其中TatP的序列為QPKTACTNC(序列號：5)
[0119] 分子克?。涸诖竽c桿菌中表達(dá)野生型HIV-lTat多肽與人鐵蛋白L鏈融合的重組蛋 白。使用PCR方法將Tat蛋白的全長cDNA與鐵蛋白輕鏈基因N端通過包含包含6個甘氨酸的連 接子連接(圖9)。
[0120] 蛋白表達(dá)和純化:通過DNA測序驗證鐵蛋白/Tat的編碼序列。將重組子轉(zhuǎn)化蛋白表 達(dá)細(xì)菌BL21(DE3)。轉(zhuǎn)化細(xì)菌生長到0D值為1.0(600nm)時，加入ImMIPTG激活T7啟動子，在30 度誘導(dǎo)表達(dá)。表達(dá)結(jié)束后將細(xì)胞重懸于B-PER緩沖液中，超聲破碎釋放蛋白。使用分子篩和 離子交換凝膠過濾層析從上清中純化重組的融合蛋白。由于融合多肽的分子較小，在本例 中使用多克隆和單克隆抗體進(jìn)行免疫印跡試驗不能得到陽性結(jié)果。
[0121] 通過下列觀察顯示顆粒具有正確構(gòu)像：
[0122] 1)分子排阻凝膠層析洗脫的純化表達(dá)產(chǎn)物具有與天然重組鐵蛋白（鐵蛋白分子 量:408K)相一致的保留效應(yīng)。
[0123] 例5顆粒外融合蛋白
[0124] HIV P24蛋白通過包含6個甘氨酸的連接子與N端連接構(gòu)成重組蛋白。
[0125] 顆?？s寫：（P24.6G.Fl)
[0126] 分子克?。涸诖竽c桿菌中表達(dá)野生型HIV-1P24與人鐵蛋白L鏈融合的重組蛋白。使 用PCR方法將Tat的全長cDNA與鐵蛋白輕鏈基因N端通過包含6個甘氨酸的連接子連接（圖 9) 〇
[0127] 蛋白表達(dá)和純化:通過DNA測序驗證鐵蛋白/P24的編碼序列。將重組子轉(zhuǎn)化蛋白表 達(dá)細(xì)菌BL21(DE3)。轉(zhuǎn)化細(xì)菌生長到0D值為1.0(600nm)時，加入ImMIPTG激活T7啟動子，在30 度誘導(dǎo)表達(dá)。表達(dá)結(jié)束后將細(xì)胞重懸于B-PER緩沖液中，超聲破碎釋放蛋白。使用分子篩和 離子交換凝膠過濾層析從上清中純化重組的融合蛋白。所表達(dá)的蛋白可能包含截短的P24 蛋白（未對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行確證）。但是使用多克隆抗體與融合顆粒蛋白進(jìn)行免疫印跡試驗 得到陽性結(jié)果。
[0128] 通過下列觀察顯示顆粒具有正確構(gòu)像：
[0129] 1)分子排阻凝膠層析洗脫的純化表達(dá)產(chǎn)物具有與天然重組鐵蛋白（鐵蛋白分子 量:408K)相一致的保留效應(yīng)；
[0130] 2)融合蛋白與P24多克隆抗體進(jìn)行免疫印跡試驗得到陽性結(jié)果。
[0131] 實施例附錄
[0132] 1 .GenBank 序列號：
[0133] 人鐵蛋