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生物感受器的穩(wěn)定用于體內(nèi)應(yīng)用

文檔序號:9927518閱讀:602來源:國知局
生物感受器的穩(wěn)定用于體內(nèi)應(yīng)用
【專利說明】生物感受器的穩(wěn)定用于體內(nèi)應(yīng)用
[0001] 本申請是申請人于2010年10月25日提交的題為"生物感受器的穩(wěn)定用于體內(nèi)應(yīng) 用"的中國專利申請201080059122.8的分案申請。
[0002] 本發(fā)明涉及制劑用于穩(wěn)定分離的蛋白質(zhì)的用途。具體而言,公開了該制劑用于穩(wěn) 定生物化學(xué)感受器中受體的用途。本發(fā)明還涉及含有此類制劑的生物化學(xué)感受器。
[0003] 經(jīng)常期望蛋白質(zhì)的技術(shù)應(yīng)用,以從干擾雜質(zhì)中釋放它們。使用純化的蛋白質(zhì)的重 要領(lǐng)域是生物化學(xué)感受器。用作生物化學(xué)感受器的受體的蛋白質(zhì)必須對分析物具有高親和 力。為了檢測分析物與受體的結(jié)合,經(jīng)常修飾受體,以使得分析物與受體之間的相互作用是 可以測量的。雜質(zhì)致使定向修飾困難,且經(jīng)常是不可能的。因此,從天然細(xì)胞和組織中提取 蛋白質(zhì)并進(jìn)行純化。
[0004] 然而,蛋白質(zhì)的純化具有缺點(diǎn),分離的蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性經(jīng)常比其在天然環(huán)境中的 穩(wěn)定性低。加入分子伴侶、氨基酸、蛋白質(zhì)(例如,BSA)、多糖或多糖衍生物經(jīng)常提高分離的 蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。經(jīng)常地,使用低或高分子量的添加劑,以減少溶液中的自由體積("分子擁 擠")。在這種情況下,可使用蛋白質(zhì)、多糖或合成的聚合物。從現(xiàn)有技術(shù)看,尤其是聚乙二 醇、Ficoll、葡聚糖、核糖核酸酶和牛血清白蛋白是已知的??赏ㄟ^"排除體積"的效果闡明 這些添加劑的效果(Chebotareva 等,2004,Biochemical Effects of Molecular Crowding,Biochemistry(Moscow),69:1522-1536)〇
[0005] 本發(fā)明的目標(biāo)因此是提供制劑,其使得分離的蛋白質(zhì)的穩(wěn)定得以提高。通過專利 權(quán)利要求書及下文中描述的實施方案實現(xiàn)該目標(biāo)。
[0006] 本發(fā)明因此涉及細(xì)胞裂解物級分用于穩(wěn)定分離的蛋白質(zhì)的用途,其中通過這樣的 方法產(chǎn)生細(xì)胞裂解物級分,所述方法包括步驟:
[0007] a)從細(xì)胞中產(chǎn)生細(xì)胞裂解物;和
[0008] b)從所述細(xì)胞裂解物中分離出分離的蛋白質(zhì),由此獲得用于穩(wěn)定所述分離蛋白質(zhì) 的細(xì)胞裂解物級分。
[0009] 優(yōu)選地,從直立刀豆(Canavalia ensiformis)中產(chǎn)生分離的蛋白質(zhì)和細(xì)胞裂解物 級分。特別優(yōu)選地,細(xì)胞裂解物級分含有前刀豆球蛋白(precanaval in)。優(yōu)選地,分離出分 離的蛋白質(zhì)后,進(jìn)一步加工所述細(xì)胞裂解物級分。優(yōu)選地,所述分離的蛋白質(zhì)是受體,非常 特別優(yōu)選伴刀豆球蛋白A。優(yōu)選地,分離的蛋白質(zhì)是生物化學(xué)感受器的組分。特別優(yōu)選地,所 述生物化學(xué)感受器還包含水凝膠顆粒中的葡聚糖和伴刀豆球蛋白。
[0010]通過提供穩(wěn)定分離的蛋白質(zhì)的細(xì)胞裂解物級分的方法可獲得本發(fā)明使用的細(xì)胞 裂解物級分,所述方法包括步驟
[0011] a)從細(xì)胞中產(chǎn)生所述細(xì)胞裂解物;和
[0012] b)分離出待從所述細(xì)胞裂解物中分離的蛋白質(zhì)。
[0013] 在該申請中,認(rèn)為"細(xì)胞"表示所有的原核或真核細(xì)胞,其表達(dá)待分離的蛋白質(zhì)。這 包括遺傳轉(zhuǎn)化的細(xì)胞,其中以重組方式表達(dá)待分離的蛋白質(zhì)。細(xì)胞可以原核或真核細(xì)胞培 養(yǎng)物的單個細(xì)胞存在或以動物或植物體或真菌的組織樣品形式存在。
[0014] 用于產(chǎn)生細(xì)胞裂解物的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知??稍诒景l(fā)明方法范圍內(nèi)使 用所有已知的機(jī)械或非機(jī)械破碎方法破碎細(xì)胞。優(yōu)選的機(jī)械破碎方法是使用旋轉(zhuǎn)刀片勻漿 (在動物細(xì)胞中)、P〇tter-Elvehjem方法、研磨細(xì)胞或組織、在研缽中用沙子磨碎、氧化錯或 玻璃珠、在超聲的情況下通過空化力進(jìn)行細(xì)胞破碎,和通過狹窄閥門的高壓擠壓細(xì)胞懸浮 液(例如在French Press中)。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道,在機(jī)械破碎方法中,以這種方式可形成 熱,以至于在許多情況下需要溫控,以防止蛋白質(zhì)變性。優(yōu)選的非機(jī)械破碎方法是細(xì)胞的反 復(fù)冰凍和融化、利用低滲溶液處理細(xì)胞、在革蘭氏陽性菌的情況下利用溶菌酶進(jìn)行處理、利 用EDTA進(jìn)行處理,隨后在革蘭氏陰性菌的情況下與溶菌酶溫育、或在酵母的情況下利用甲 苯進(jìn)行處理。當(dāng)然,所述方法的多種要素可與另一種方法或此處未提及的其他破碎方法組 合。
[0015] 在破碎過程中,必須保護(hù)蛋白質(zhì)免于有害影響。優(yōu)選地,使用冷或特異的抑制劑, 以防止蛋白酶對蛋白質(zhì)的降解。為了保護(hù)巰基,優(yōu)選使用還原劑,特別優(yōu)選二硫蘇糖醇或二 硫赤蘚糖醇。為了保護(hù)免于重金屬離子,優(yōu)選乙二胺四乙酸(EDTA)。這也結(jié)合可激活蛋白酶 的二價陽離子。為了防止蛋白質(zhì)凝集,優(yōu)選使用非離子型去污劑。
[0016] 優(yōu)選地,任選采取的破碎方法和任何保護(hù)措施不僅適合于在細(xì)胞裂解物中以活性 形式存在的想要的蛋白質(zhì),還適合于所述細(xì)胞裂解物的組分,其介導(dǎo)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定,所述蛋 白質(zhì)也必須不能在功能上被所選破碎方法損壞。
[0017] 在其實際應(yīng)用前,分離的蛋白質(zhì)在許多情況下是被修飾了的。例如,用于生物化學(xué) 感受器的受體經(jīng)常被標(biāo)記。通過共價修飾受體,例如使用熒光染料進(jìn)行該標(biāo)記。為了待穩(wěn)定 的經(jīng)修飾的分離蛋白質(zhì)不被細(xì)胞裂解物級分中存在的非修飾蛋白質(zhì)稀釋,優(yōu)選從所述細(xì)胞 裂解物中分離待分離的蛋白質(zhì)。表述"分離待從細(xì)胞裂解物中分離的蛋白質(zhì)"表示純化想要 的蛋白質(zhì)。結(jié)果,存在至少一種細(xì)胞裂解物,其含有蛋白質(zhì)作為分離的蛋白質(zhì)。此外,單獨(dú)存 在至少一種細(xì)胞裂解物級分,其不含有上述蛋白質(zhì)或僅含有很少量的上述蛋白質(zhì)。從其天 然環(huán)境,即從這樣的分子中分離所述分離蛋白質(zhì),其與所述分子一起存在于細(xì)胞裂解物中。 優(yōu)選地,基于來自其天然環(huán)境的分子,所述分離的蛋白質(zhì)以至少50%、至少75%、至少80%、 至少90%、至少95%,或特別優(yōu)選地,至少99% (重量/重量)的純度存在。含有分離的蛋白質(zhì) 的細(xì)胞裂解物級分可含有任何想要量的分子,其不來自所述蛋白質(zhì)的天然環(huán)境,卻是在純 化過程中或在純化后添加進(jìn)去的。其一個實例是所用緩沖液的組分。
[0018] 用于從細(xì)胞裂解物中分離待分離的蛋白質(zhì)的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知。優(yōu)選方 法是沉淀和差異增溶、超速離心、層析方法和電泳。
[0019]優(yōu)選通過加入升高濃度的硫酸銨完成蛋白質(zhì)的沉淀。根據(jù)所達(dá)到的硫酸銨濃度, 以這種方法可連續(xù)沉淀出不同溶解度的蛋白質(zhì)級分,并且可進(jìn)行分離。同等優(yōu)選的是通過 使用合適的緩沖液酸化培養(yǎng)基來沉淀蛋白質(zhì)。
[0020] 超速離心基于這樣的原理,在離心產(chǎn)生的重力場內(nèi),顆粒密度越高并且越緊密,其 沉降得越快。因為足夠長離心過程中建立的離心力和浮力之間的平衡,各蛋白質(zhì)在容器中 在浮力和離心力彼此平衡的點(diǎn)上積聚。使用蔗糖梯度可利于該方法。
[0021] 層析分離蛋白質(zhì)基于這樣的原理,所述蛋白質(zhì)溶解在流動相中,優(yōu)選緩沖液中,移 動經(jīng)過靜止相。以這樣的方式選擇相,其中來自蛋白質(zhì)混合物的不同濃度的各蛋白質(zhì)與固 相之間的相互作用產(chǎn)生各蛋白質(zhì)級分經(jīng)過靜止相的不同長度的流動時間。蛋白質(zhì)與靜止相 怎樣相互作用的方式取決于層析的類型。用于分離蛋白質(zhì)的優(yōu)選層析方法是大小排阻層析 (基于待分離的各蛋白質(zhì)的不同大?。⒂H和層析(基于各蛋白質(zhì)特異性結(jié)合柱材料的能 力)、離子交換層析(基于多種蛋白質(zhì)的不同等電點(diǎn))和反相層析(基于多種蛋白質(zhì)的不同疏 水性)。
[0022] 在本專利申請的范圍內(nèi),表述"分離的蛋白質(zhì)"表示任何蛋白質(zhì),其中對其功能狀 態(tài)的分離具有興趣。下文中,同義使用表述"想要的蛋白質(zhì)"。本申請的上下文中,分離的蛋 白質(zhì)優(yōu)選包含酶、受體、調(diào)節(jié)性蛋白質(zhì)、轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞骨架蛋
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