分的這種分離，以從所述細(xì)胞裂解物 級(jí)分中去除阻止蛋白質(zhì)工業(yè)應(yīng)用的那些分子。為了從穩(wěn)定蛋白質(zhì)的細(xì)胞裂解物級(jí)分中分離 分子亞群，可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的分離分子混合物的所有方法。優(yōu)選地，使用那些分 離方法，在上文中為純化蛋白質(zhì)描述了所述方法。
[0039] 本發(fā)明潛在研究的上下文中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)前刀豆球蛋白特別高度適合穩(wěn)定分離的蛋 白質(zhì)。因此，穩(wěn)定分離的蛋白質(zhì)的細(xì)胞裂解物級(jí)分的進(jìn)一步處理優(yōu)選為富集前刀豆球蛋白。
[0040] 優(yōu)選通過(guò)這樣的方法富集前刀豆球蛋白，所述方法包括步驟：
[0041] 1.在合適的緩沖液中懸浮刀豆粉；
[0042] 2.使用Superdex 200柱層析分離伴刀豆球蛋白A。前刀豆球蛋白定位在非結(jié)合級(jí) 分；
[0043] 3.非結(jié)合級(jí)分針對(duì)水進(jìn)行透析；
[0044] 4.凍干非結(jié)合級(jí)分；
[0045] 5.將非結(jié)合級(jí)分與酸性沉淀緩沖液，優(yōu)選50mM乙酸鈉，pH 4.4混合，隨后離心；
[0046] 6.用蒸餾水洗滌沉淀，隨后離心；
[0047] 7 .將剩余的沉淀用在合適的緩沖液，優(yōu)選1 % (重量/重量)NaCl和0.1 % (重量/重 量)K2HP〇4，pH 7.0吸收，并離心；
[0048] 8.離心后，收集上清液；
[0049] 9.將離心后剩余的沉淀吸收在氯化鈉溶液，優(yōu)選5% (重量/重量)中，并再次離心；
[0050] 10.將步驟9中獲得的上清液與來(lái)自步驟8的上清液組合；
[0051 ] 11.組合的上清液針對(duì)蒸餾水進(jìn)行透析；
[0052] 12.通過(guò)酸-堿提取，優(yōu)選使用1N乙酸，pH 5.1沉淀濃縮前刀豆球蛋白，并在0.01N NaOH中吸收沉淀，其中在堿中吸收后的pH不高于8.0;
[0053] 13.針對(duì)為隨后離子交換層析提供的應(yīng)用緩沖液，優(yōu)選20mM Tris，100mM NaCl，pH 7.2進(jìn)行透析；
[0054] 14.優(yōu)選使用DEAE Sepharose FF柱和步驟13中提及的應(yīng)用緩沖液進(jìn)行離子交換 層析，優(yōu)選利用增加的鹽梯度進(jìn)行洗脫；
[0055] 15.優(yōu)選使用SDS-PAGE鑒定最純級(jí)分，合并這些級(jí)分；
[0056] 16.針對(duì)蒸餾水進(jìn)行透析;和
[0057] 17.冰凍干燥前刀豆球蛋白。
[0058]特別優(yōu)選地，通過(guò)簡(jiǎn)化方法富集前刀豆球蛋白，所述方法包括步驟：
[0059] 1.在合適的緩沖液中懸浮刀豆粉；
[0060] 2.優(yōu)選使用DEAE Sepharose FF柱進(jìn)行離子交換層析，優(yōu)選利用增加的鹽梯度進(jìn) 行洗脫；
[0061 ] 3.優(yōu)選使用SDS-PAGE鑒定最純級(jí)分，合并這些級(jí)分；
[0062] 4.針對(duì)蒸餾水進(jìn)行透析;和
[0063] 5.冰凍干燥前刀豆球蛋白。
[0064] 本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施方案涉及含前刀豆球蛋白的制劑用于穩(wěn)定分離的蛋白質(zhì) 的用途。特別優(yōu)選的是上述制劑用于穩(wěn)定伴刀豆球蛋白A的用途。
[0065] "含前刀豆球蛋白的制劑"優(yōu)選為液體或固體形式。優(yōu)選地，除了前刀豆球蛋白，所 述制劑也含有來(lái)自分離的蛋白質(zhì)的細(xì)胞環(huán)境的其他組分。同樣優(yōu)選地，所述制劑含有分子 伴侶、牛血清白蛋白和/或相容的溶質(zhì)。進(jìn)一步優(yōu)選地，所述制劑含有有機(jī)或無(wú)機(jī)緩沖液物 質(zhì)。抑制細(xì)菌和真菌生長(zhǎng)的防腐劑和濕潤(rùn)劑也優(yōu)選為本發(fā)明制劑的組分。本發(fā)明制劑干物 質(zhì)的前刀豆球蛋白的重量分?jǐn)?shù)優(yōu)選為至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、 97%、98%、99% 或 99.5%。
[0066] 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，以重組方式產(chǎn)生本發(fā)明制劑中含有的前刀豆球蛋白。
[0067] 用于重組制備蛋白質(zhì)的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。將編碼前刀豆球蛋白的核 酸序列引入使得可以在所選宿主生物中表達(dá)前刀豆球蛋白的表達(dá)載體中。為此，優(yōu)選將編 碼前刀豆球蛋白的核酸序列置于合適的調(diào)節(jié)序列控制下。合適的調(diào)節(jié)序列是，例如用于大 腸桿菌(E.coli)的lac、trp、或tac啟動(dòng)子，用于酵母的A0X1或GAL-1啟動(dòng)子，或用于植物的 CaMV啟動(dòng)子。為了用于動(dòng)物細(xì)胞，優(yōu)選CMV、SV40或RSV (勞斯肉瘤病毒)啟動(dòng)子，還有CMV增強(qiáng) 子、SV40增強(qiáng)子或珠蛋白-內(nèi)含子。優(yōu)選的表達(dá)載體是質(zhì)粒、噬菌體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和人工 染色體。用于重組制備前刀豆球蛋白的優(yōu)選宿主生物是植物、原核生物和真菌，或哺乳動(dòng) 物。優(yōu)選通過(guò)電穿孔、使用磷酸鈣或氯化銣沉淀，或通過(guò)熱激將質(zhì)粒引入宿主細(xì)胞中。用于 轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的優(yōu)選方法是轟擊接種和根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)介導(dǎo)的 轉(zhuǎn)化。
[0068] 本發(fā)明還涉及穩(wěn)定分離的蛋白質(zhì)的方法，所述方法包括向所述分離的蛋白質(zhì)中加 入含前刀豆球蛋白的本發(fā)明制劑。
[0069] 向想要的蛋白質(zhì)中加入含前刀豆球蛋白的本發(fā)明制劑使得可以精確施加本發(fā)明 制劑?？梢赃@種方式實(shí)現(xiàn)想要蛋白質(zhì)的確定且可重復(fù)性的穩(wěn)定化。優(yōu)選地，干燥的制劑以固 體加入到含有想要蛋白質(zhì)的溶液中，并在其中進(jìn)行溶解。同樣優(yōu)選地，向含有想要的蛋白質(zhì) 的溶液中加入本發(fā)明制劑的貯存液。特別優(yōu)選將含前刀豆球蛋白的本發(fā)明制劑摻入到水凝 膠顆粒中，非常特別優(yōu)選摻入到藻酸鹽珠子中，其中所述水凝膠顆粒也含有所述分離的蛋 白質(zhì)。
[0070] 在本發(fā)明方法的優(yōu)選實(shí)施方案中，分離的蛋白質(zhì)是受體，更優(yōu)選是凝集素，并更優(yōu) 選是伴刀豆球蛋白A。
[0071] 本發(fā)明還涉及本發(fā)明細(xì)胞裂解物級(jí)分用于穩(wěn)定分離的蛋白質(zhì)的用途，其中所述分 離的蛋白質(zhì)是生物化學(xué)感受器的組分。
[0072] "生物化學(xué)感受器"含有分子，優(yōu)選蛋白質(zhì)，其能夠以高親和力結(jié)合待檢測(cè)的物質(zhì)。 該蛋白質(zhì)在下文中表示為"受體"。根據(jù)本發(fā)明制備的生物化學(xué)感受器含有至少一種受體， 還含有在穩(wěn)定受體/受體的細(xì)胞裂解物級(jí)分中存在的分子。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，生物化學(xué) 感受器還含有其他分子。
[0073] 分析物與受體的結(jié)合使得能夠定性地，還優(yōu)選定量地檢測(cè)樣品中的分析物。認(rèn)為 定性檢測(cè)表示觀察樣品中分析物的存在或缺失。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，根據(jù)所用的感受器， 定性檢測(cè)具有比較低的檢測(cè)極限，即所述樣品必須具有確定的最小濃度的分析物，以能夠 確定其存在。定量檢測(cè)分析物還傳遞了樣品中分析物的量或濃度的信息。為了可測(cè)量受體 與分析物之間的相互作用，優(yōu)選化學(xué)修飾所用的蛋白質(zhì)。特別優(yōu)選通過(guò)熒光染料標(biāo)記分離 的蛋白質(zhì)。
[0074] 術(shù)語(yǔ)"樣品"表示任何這樣的液體，其中的分析物待于檢測(cè)。優(yōu)選血液、血漿、血清、 淚液、組織液和尿，特別優(yōu)選眼結(jié)膜下的組織液。同樣優(yōu)選的是組織樣品。所述樣品優(yōu)選存 在為從患者身體分離的樣品。更優(yōu)選地，所述樣品存在于其天然位置中。在這種情況下，將 感受器優(yōu)選引入患者體內(nèi)，并在樣品定位的位點(diǎn)上直接使用。
[0075] 在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，生物化學(xué)感受器含有伴刀豆球蛋白A作為受體。此類 生物化學(xué)受體可用于測(cè)定樣品中葡萄糖的濃度，因?yàn)榘榈抖骨虻鞍譇結(jié)合葡萄糖。在該情況 下，除了受體和穩(wěn)定受體的細(xì)胞裂解物級(jí)分，所述生物化學(xué)感受器優(yōu)選含有水凝膠。優(yōu)選合 成分子、生物分子或修飾的生物分子的水凝膠。優(yōu)選的合成分子是聚丙烯酸酯、聚丙烯酰胺 和聚乙烯醇。優(yōu)選的生物分子是明膠、鹿角菜膠、瓊脂糖、直鏈淀粉、支鏈淀粉、藻酸鹽、吉蘭 糖膠、纖維素和纖維素衍生物。特別優(yōu)選聚乙烯醇和藻酸鹽。如果