白質(zhì)、結(jié)合蛋白質(zhì)和膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋 白，特別優(yōu)選受體。非常特別優(yōu)選地，所分離的蛋白質(zhì)是伴刀豆球蛋白A。在所述方法的范圍 內(nèi)，所分離的蛋白質(zhì)可作為純的物質(zhì)或部分純化形式存在。優(yōu)選地，分離的蛋白質(zhì)或分離蛋 白質(zhì)的制劑包含低于50%、低于25%、低于10%、低于5%、低于1 %、或低于0.5%的作為雜 質(zhì)的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)和細(xì)胞組分。
[0023] 認(rèn)為"酶"表示任何蛋白質(zhì)，其能夠催化化學(xué)反應(yīng)。在該方法中，在化學(xué)反應(yīng)的上下 文中，其他分子被轉(zhuǎn)化還是酶自動(dòng)催化起作用均不是重要的。
[0024] "受體"是任何蛋白質(zhì)，其能夠特異性結(jié)合分子、配體，并響應(yīng)這種結(jié)合，構(gòu)象改變 或活性改變。也可以這樣的方式化學(xué)修飾在其天然狀態(tài)中對(duì)與配體的結(jié)合不顯示反應(yīng)的蛋 白質(zhì)，其中配體的結(jié)合導(dǎo)致蛋白質(zhì)的可測(cè)量的改變。此外，通過(guò)熒光標(biāo)記的受體與同樣熒光 標(biāo)記的配體的組合，競(jìng)爭(zhēng)性測(cè)定是可能的。在樣品中缺少未標(biāo)記配體的情況下，僅熒光標(biāo)記 的配體結(jié)合受體。兩種熒光染料在空間上的接近影響了其光的發(fā)射。如果未標(biāo)記的配體然 后存在于樣品中，那么所述未標(biāo)記配體取代了來(lái)自受體的熒光標(biāo)記配體，并因此改變了系 統(tǒng)的光發(fā)射。系統(tǒng)光發(fā)射的改變因此取決于未標(biāo)記配體的量，所述未標(biāo)記配體與樣品一起 被引入系統(tǒng)并取代來(lái)自受體的標(biāo)記配體。特異性結(jié)合表示所述配體比其他物質(zhì)以顯著更高 的親和力結(jié)合。優(yōu)選地，所述配體以比其他配體高至少10倍、100倍、1000倍、10000倍或 100000倍的親和力結(jié)合。配體優(yōu)選為離子、小分子、核酸(單鏈或雙鏈形式的DNA或RNA)或任 何長(zhǎng)度的其他蛋白質(zhì)。小分子可屬于任何已知類(lèi)型的分子。它們優(yōu)選為脂類(lèi)、脂肪酸、嘌呤、 嘧啶、糖、生物堿、氨基酸、生物胺、類(lèi)異戊二烯或類(lèi)固醇。特別優(yōu)選地，小分子是糖，非常特 別優(yōu)選葡萄糖。特別優(yōu)選地，受體是凝集素，非常特別優(yōu)選伴刀豆球蛋白A。
[0025] 凝集素是能夠特異性結(jié)合碳水化合物結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)。它們?cè)趧?dòng)物、植物和細(xì)菌中 參與許多類(lèi)型的分子和細(xì)胞識(shí)別過(guò)程，并且不具有酶功能。許多凝集素被糖基基團(tuán)進(jìn)行了 翻譯后修飾。
[0026] 伴刀豆球蛋白A是可結(jié)合a-D-葡萄糖和類(lèi)似糖，但不與其酶促反應(yīng)的凝集素。單體 由237個(gè)氨基酸組成，并含有錳和鈣。在中性pH下，其形成在酸性范圍內(nèi)分解成兩個(gè)二聚體 的四聚體。其以特別高的濃度出現(xiàn)在直立刀豆(Canavalia ensiformis)中。伴刀豆球蛋白A 優(yōu)選具有SEQ ID NO:3定義的氨基酸序列。
[0027]在該申請(qǐng)中，那些蛋白質(zhì)定義為"調(diào)節(jié)蛋白"，其與其他蛋白質(zhì)相互作用，并由此改 變這些蛋白質(zhì)的活性。結(jié)果是相互作用配偶體活性降低(抑制)或活性增加(激活）。調(diào)節(jié)子 的結(jié)合配偶體優(yōu)選為酶。在該情況下，調(diào)節(jié)子的結(jié)合影響對(duì)底物的親和力或所述底物的酶 促反應(yīng)的速率。同樣優(yōu)選地，結(jié)合配偶體是受體。在該情況下，所述調(diào)節(jié)子可作為激動(dòng)劑起 作用，即可通過(guò)結(jié)合受體而激活受體，或所述調(diào)節(jié)子可作為拮抗劑結(jié)合受體，但在該結(jié)合過(guò) 程中并不激活所述受體。另外優(yōu)選地，結(jié)合配偶體是轉(zhuǎn)錄因子。在該情況下，調(diào)節(jié)子的結(jié)合 影響轉(zhuǎn)錄因子修飾基因表達(dá)這部分的能力。
[0028]在該申請(qǐng)的上下文中，"轉(zhuǎn)錄因子"是這樣的蛋白質(zhì)，其活性由促進(jìn)或抑制細(xì)胞中 一個(gè)或多個(gè)基因的表達(dá)組成。
[0029] "結(jié)合蛋白"是能夠特異性結(jié)合其他分子(配體)的蛋白質(zhì)。特異性結(jié)合表示配體以 比其他物質(zhì)顯著更高的親和力結(jié)合。優(yōu)選地，所述配體以比其他配體高至少10倍、100倍、 1000倍、10000倍或100000倍的親和力結(jié)合。
[0030] 認(rèn)為表述"膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白"表示使得其他分子能夠通過(guò)細(xì)胞膜或促進(jìn)其通過(guò)細(xì)胞膜 的那些蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)定位在細(xì)胞膜上。
[0031] 細(xì)胞骨架蛋白質(zhì)是這樣的蛋白質(zhì)，其穩(wěn)定細(xì)胞的空間結(jié)構(gòu)，并與動(dòng)力蛋白組合，介 導(dǎo)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)過(guò)程。細(xì)胞骨架蛋白優(yōu)選為肌動(dòng)蛋白、中間絲和微管。與肌動(dòng)蛋白絲、微管結(jié)合 的動(dòng)力蛋白優(yōu)選為驅(qū)動(dòng)蛋白、動(dòng)力蛋白和肌球蛋白。
[0032] 術(shù)語(yǔ)"穩(wěn)定"表示分離的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和/或功能的維持。因?yàn)榈鞍踪|(zhì)的結(jié)構(gòu)是其 功能的重要前提，穩(wěn)定蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)優(yōu)選導(dǎo)致維持蛋白質(zhì)的功能。待穩(wěn)定的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)優(yōu) 選為蛋白質(zhì)在其天然環(huán)境中，即在組織或細(xì)胞中的結(jié)構(gòu)。本發(fā)明的制劑優(yōu)選穩(wěn)定分離蛋白 質(zhì)的二級(jí)、三級(jí)或四級(jí)結(jié)構(gòu)。在本發(fā)明的上下文中，認(rèn)為穩(wěn)定表示分離蛋白質(zhì)的分子的統(tǒng)計(jì) 學(xué)顯著性比例的穩(wěn)定。例如，耗盡本發(fā)明的制劑后，功能分離的蛋白質(zhì)的回收率優(yōu)選為至少 50%、至少75%、至少80%、至少90%、至少95%，或特別優(yōu)選至少99%?；厥章室虼丝蓽y(cè)定 為添加本發(fā)明制劑和儲(chǔ)存后分離的蛋白質(zhì)的功能分子與分離的蛋白質(zhì)分子總量的比例。優(yōu) 選地，為了測(cè)定回收率，在添加本發(fā)明制劑之前和之后并在稍后時(shí)間點(diǎn)上立即比較含有分 離蛋白質(zhì)的制劑的活性。此外，在相同時(shí)間點(diǎn)上不添加本發(fā)明制劑的情況下利用分離蛋白 質(zhì)的制劑進(jìn)行比較。
[0033]本發(fā)明有利地可以提尚分尚的蛋白質(zhì)，具體而目受體的穩(wěn)定化。如實(shí)施例5中顯 示，伴刀豆球蛋白A通過(guò)來(lái)自直立刀豆種子的非結(jié)合細(xì)胞裂解物級(jí)分比通過(guò)牛血清白蛋白 更好地穩(wěn)定化，牛血清白蛋白在現(xiàn)有技術(shù)中作為蛋白質(zhì)的穩(wěn)定劑。穩(wěn)定分離的蛋白質(zhì)的本 發(fā)明細(xì)胞裂解物級(jí)分的其他令人驚訝的優(yōu)勢(shì)是高壓滅菌這些細(xì)胞裂解物級(jí)分而不損壞其 活性的可能性。對(duì)于穩(wěn)定分離的蛋白質(zhì)的本發(fā)明細(xì)胞裂解物級(jí)分在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用，這 是極其有利的，因?yàn)橐赃@種方式可保證細(xì)胞裂解物級(jí)分不含有病菌。
[0034] 在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，從刀豆(Canavalis ensiformis)的種子中產(chǎn)生分離 的蛋白質(zhì)和穩(wěn)定分離的蛋白質(zhì)的細(xì)胞裂解物級(jí)分。
[0035] 在本發(fā)明特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，穩(wěn)定分離的蛋白質(zhì)的細(xì)胞裂解物級(jí)分含有前刀 豆球蛋白。如果產(chǎn)生待分離的蛋白質(zhì)的細(xì)胞不含有或不含有充足的天然形式的前刀豆球蛋 白，優(yōu)選以重組方式在該細(xì)胞中表達(dá)前刀豆球蛋白。同樣優(yōu)選向細(xì)胞裂解物中添加前刀豆 球蛋白。
[0036] 術(shù)語(yǔ)"前刀豆球蛋白"表示在刀豆(直立刀豆）的種子中含有的蛋白質(zhì)。前刀豆球蛋 白單體在變性條件下的凝膠電泳中顯示49000道爾頓的分子量。胰蛋白酶將前刀豆球蛋白 切割成各自24000和25000道爾頓分子量的兩個(gè)肽。在允許這些切割產(chǎn)物結(jié)晶的情況下，胰 蛋白酶將兩個(gè)肽中更大的肽第二次切割（Campbel 1 Smith等，1982, Biochemical Characterization of Canavalin，the Major Storage Protein of Jack Bean,Plant Physiology,70:1199-1209)。優(yōu)選地，刀豆球蛋白具有SEQ ID N0:2中定義的氨基酸序列。 在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，前刀豆球蛋白具有與SEQ ID NO: 2定義的氨基酸序列至少 60%、70%、80%、90%、95%、97%、98%或99%的序列同一性。優(yōu)選地，具有5￡〇10勵(lì):1定 義的序列的多核苷酸編碼前刀豆球蛋白。在實(shí)施例1中描述了用于提供來(lái)自刀豆的純化的 前刀豆球蛋白的方法。
[0037] 在本發(fā)明的其他優(yōu)選實(shí)施方案中，進(jìn)一步處理穩(wěn)定分離的蛋白質(zhì)的細(xì)胞裂解物級(jí) 分。
[0038] 該處理優(yōu)選包括添加蛋白酶抑制劑和/或通過(guò)螯合劑結(jié)合游離金屬離子。此外，優(yōu) 選對(duì)穩(wěn)定蛋白質(zhì)的細(xì)胞裂解物級(jí)分滅菌。非常特別優(yōu)選地，所述處理包括富集組分亞群，其 特別有效地穩(wěn)定細(xì)胞裂解物級(jí)分中的分離的蛋白質(zhì)。同樣，非常特別優(yōu)選從細(xì)胞裂解物級(jí) 分中分離干擾組分。使用穩(wěn)定蛋白質(zhì)的細(xì)胞裂解物級(jí)