生物化學(xué)感受器含有所述 水凝膠，那么在多相中存在受體和分析物。
[0076] 在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，生物化學(xué)感受器含有水凝膠顆粒，其中存在穩(wěn)定分離 的蛋白質(zhì)的細(xì)胞裂解物級分、葡聚糖和伴刀豆球蛋白A。
[0077]此外，本發(fā)明涉及穩(wěn)定分離的蛋白質(zhì)的本發(fā)明細(xì)胞裂解物級分或含前刀豆球蛋白 的制劑用于制備生物化學(xué)感受器中的用途。
[0078] 本發(fā)明還提供包含分離的蛋白質(zhì)和穩(wěn)定所述分離的蛋白質(zhì)的細(xì)胞裂解物級分的 生物化學(xué)感受器，如上定義。優(yōu)選地，所述生物化學(xué)感受器包含受體作為分離的蛋白質(zhì)，特 別優(yōu)選伴刀豆球蛋白A。優(yōu)選地，在水凝膠顆粒中，細(xì)胞裂解物級分與葡聚糖和分離的蛋白 質(zhì)，優(yōu)選受體，特別優(yōu)選伴刀豆球蛋白A包含在一起。
[0079] 同樣，本發(fā)明提供包含伴刀豆球蛋白A和前刀豆球蛋白的生物化學(xué)感受器。優(yōu)選 地，伴刀豆球蛋白A和前刀豆球蛋白與葡聚糖一起包含在水凝膠顆粒中。
[0080] 下文示例性實(shí)施方案僅用于闡明本發(fā)明。它們不旨在以任何方式限制權(quán)利要求書 的主題。 實(shí)施例
[0081] 實(shí)施例1:產(chǎn)生刀豆的非結(jié)合級分
[0082]將300g刀豆粉(直立刀豆）懸浮在100mM緩沖液中，并過濾去除膜組分。將總共30g 蛋白質(zhì)應(yīng)用到Superdex 200柱上，并收集了不結(jié)合柱材料的蛋白質(zhì)級分?？偣搏@得了3升非 結(jié)合級分(nbF)。溶液針對水進(jìn)行透析。然后進(jìn)行冰凍干燥(凍干）。可將凍干的物質(zhì)吸收在 工作緩沖液中。
[0083]實(shí)施例2:純化前刀豆球蛋白
[0084]從非結(jié)合級分中提取粗級分前刀豆球蛋白
[0085] 8.Og透析和冰凍nbF與沉淀緩沖液(50mM乙酸鈉，pH 4.4)混合，溫育，然后離心。用 水洗滌沉淀的沉淀物，并再次離心。將沉淀物溶解在800ml磷酸氫鹽溶液（1 % (w/v)NaCl + 0.1 % (w/v)K2HP〇4，pH 7.0)中。離心后收集上清液。將沉淀物溶解在500ml的5 %強(qiáng)度氯化鈉 溶液中，然后離心。鹽提取液的組合上清液針對雙蒸水進(jìn)行透析。將透析物離心。去除沉淀 物，并使用1N乙酸將上清液調(diào)整至pH 5.1，用于沉淀。沉淀批次溫育過夜，并在第二天進(jìn)行 離心。沉淀物被吸收在50ml的0.01N NaOH中，并以存在基本上澄清溶液的方式與6ml的0.1N NaOH混合。檢測pH，其不應(yīng)超過pH 8.0。批次在4°C溫育過夜。將酸-堿提取步驟重復(fù)一次。最 后獲得的堿性前刀豆球蛋白提取物針對2〇1^作18緩沖液，10〇11^他(：14117.2進(jìn)行透析。 [0086] 純化前刀豆球蛋白
[0087] 通過DEAE-陰離子交換層析(DEAE Sepharose FF)純化前刀豆球蛋白。將蛋白質(zhì)應(yīng) 用到利用應(yīng)用緩沖液(2〇1^作18緩沖液，10〇11^似(：14117.2)平衡的柱子上，隨后用緩沖 液洗滌，直至280nm處的基礎(chǔ)吸收線穩(wěn)定了，然后進(jìn)行洗脫(洗脫緩沖液:20mM Tris緩沖液， 謂似(：14117.2)。使用0-100%的鹽梯度進(jìn)行洗脫。通過303-?46￡分析洗脫級分后，合并最 純的級分。純化的前刀豆球蛋白針對雙蒸水透析過夜，然后進(jìn)行凍干。
[0088]實(shí)施例3:制備含有非結(jié)合級分(或前刀豆球蛋白）的水凝膠顆粒
[0089]將2g藻酸鈉鹽和8g非結(jié)合級分(或前刀豆球蛋白）在250ml錐形瓶中攪拌的情況下 溶解在200g水中。在5L燒杯中，將66.2g的CaCl2.2H20溶解在4931.3g水中。
[0090]藻酸鹽/蛋白質(zhì)溶液通過栗傳遞到雙流體噴嘴中。同時，在噴嘴的第二個入口處， 以這樣的方式應(yīng)用壓縮空氣，其中藻酸鹽/蛋白質(zhì)溶液被霧化成細(xì)液滴。氣流攜帶液滴進(jìn)入 含有氯化鈣溶液的超聲波浴，在那里形成膠體并沉到底部。然后收集凝膠化的球，并任選地 進(jìn)行尚壓滅菌。
[0091 ]實(shí)施例4:葡萄糖感受器的體外穩(wěn)定性測試
[0092]在各情況下在lml生理緩沖液中37°C下儲存葡萄糖感受器。適當(dāng)?shù)膬Υ鏁r間后，移 動葡萄糖感受器并測定多種葡萄糖濃度下的熒光光譜。隨著葡萄糖含量增加，熒光強(qiáng)度的 改變作為葡萄糖感受器質(zhì)量的量度。不同儲存時間的感受器與非儲存感受器比較，并測定 隨儲存時間與葡萄糖反應(yīng)中的絕對降低和百分比降低。
[0093] 表1比較顯示了在50到250mg/dl的生理葡萄糖范圍內(nèi)用非結(jié)合級分和前刀豆球蛋 白穩(wěn)定的感受器響應(yīng)，表示為葡萄糖濃度每mg/dl增加信號變化的百分比。非結(jié)合級分和前 刀豆球蛋白給出了相同的結(jié)果。
[0094]表1:穩(wěn)定化葡萄糖感受器的可儲存性
[0096]實(shí)施例5:使用多種可能的穩(wěn)定劑相對于非穩(wěn)定化感受器的穩(wěn)定性測試的結(jié)果
[0097] 表2顯示了在生理條件下儲存120天后的值。然而已知的穩(wěn)定劑如BSA、HAS不穩(wěn)定 感受器系統(tǒng)，通過來自豆粉提取物的非結(jié)合級分實(shí)現(xiàn)標(biāo)記的穩(wěn)定化(也經(jīng)過高壓滅菌）。 [0098]表2:多種穩(wěn)定劑的比較
【主權(quán)項】
1. 細(xì)胞裂解物級分用于穩(wěn)定分離的蛋白質(zhì)的用途，其中通過這樣的方法產(chǎn)生所述細(xì)胞 裂解物級分，所述方法包括步驟： a) 從細(xì)胞中產(chǎn)生所述細(xì)胞裂解物;和 b) 從所述細(xì)胞裂解物中分離出所述分離的蛋白質(zhì)，由此獲得用于穩(wěn)定所述分離的蛋白 質(zhì)的細(xì)胞裂解物級分。2. 權(quán)利要求1的用途，其中從直立刀豆產(chǎn)生所述分離的蛋白質(zhì)和所述細(xì)胞裂解物級分。3. 權(quán)利要求2的用途，其中所述細(xì)胞裂解物級分含有前刀豆球蛋白。4. 權(quán)利要求1到3任何一項的用途，其中分離出所述分離的蛋白質(zhì)后進(jìn)一步處理所述細(xì) 胞裂解物級分。5. 權(quán)利要求1到4任何一項的用途，其中所述分離的蛋白質(zhì)是受體。6. 權(quán)利要求5的用途，其中所述受體是伴刀豆球蛋白A。7. 權(quán)利要求1到6任何一項的用途，其中所述分離的蛋白質(zhì)是生物化學(xué)感受器的組分。8. 權(quán)利要求7的用途，其中所述生物化學(xué)感受器還包含水凝膠顆粒中的葡聚糖和伴刀 ?球蛋白。9. 含前刀豆球蛋白制劑用于穩(wěn)定伴刀豆球蛋白Α的用途。10. 生物化學(xué)感受器，其包含分離的蛋白質(zhì)和穩(wěn)定權(quán)利要求1到6任何一項定義的分離 的蛋白質(zhì)的細(xì)胞裂解物級分。11. 權(quán)利要求10的生物化學(xué)感受器，其中所述受體是伴刀豆球蛋白A。12. 權(quán)利要求9或10的生物化學(xué)感受器，其中所述細(xì)胞裂解物級分與水凝膠顆粒中的葡 聚糖和伴刀豆球蛋白A包含在一起。13. 生物化學(xué)感受器，其包含伴刀豆球蛋白A和前刀豆球蛋白。14. 權(quán)利要求13的生物化學(xué)感受器，其中所述伴刀豆球蛋白A和前刀豆球蛋白與水凝膠 顆粒中的葡聚糖包含在一起。
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于穩(wěn)定分離的蛋白質(zhì)的制劑的用途。具體而言，公開了該制劑用于在生物化學(xué)感受器中穩(wěn)定受體的用途。本發(fā)明還涉及含有此類制劑的生物化學(xué)感受器。
【IPC分類】C07K1/00, G01N33/566, G01N33/68, G01N33/544, C07K14/42
【公開號】CN105713080
【申請?zhí)枴緾N201610074641
【發(fā)明人】P·赫布雷克特斯梅爾, A·米勒, M·克努特, K·尼克勞斯
【申請人】視覺股份公司
【公開日】2016年6月29日
【申請日】2010年10月25日
【公告號】CA2778361A1, CN102695721A, EP2314608A1, EP2493915A1, US8945942, US20120258551, WO2011054690A1