用于測(cè)定草酸濃度的試劑、試劑盒、試紙及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及腎結(jié)石早期診斷與預(yù)防領(lǐng)域，具體涉及一種用于測(cè)定草酸濃度的試 劑、試劑盒、試紙及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 泌尿系結(jié)石是泌尿外科的常見(jiàn)疾病之一，占泌尿外科的疾病的40%~50%。歐美 國(guó)家的流行病學(xué)資料顯示，5%~10%的人在其一生中至少發(fā)生1次泌尿系結(jié)石，歐洲泌尿 系結(jié)石年新發(fā)病率約為100~400/10萬(wàn)人。近年來(lái)，我國(guó)泌尿系結(jié)石的發(fā)病率有增加趨勢(shì)， 是世界上3大結(jié)石高發(fā)區(qū)之一，我國(guó)泌尿系結(jié)石的發(fā)病率為1%~5%，南方局部地區(qū)高達(dá) 5%~10% ;年新發(fā)病率約為150~200/10萬(wàn)人，其中25%的患者需住院治療。
[0003] 據(jù)臨床數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，結(jié)石患者在治療病愈后，一年內(nèi)的結(jié)石復(fù)發(fā)率為5~10%，5年 內(nèi)的復(fù)發(fā)率為30~50%。因此，有患過(guò)結(jié)石的人在治療后，仍然屬于患結(jié)石的高風(fēng)險(xiǎn)人群， 更加需要診斷自己身體狀態(tài)，了解罹患結(jié)石風(fēng)險(xiǎn)，及早發(fā)現(xiàn)并預(yù)防，避免結(jié)石復(fù)發(fā)。
[0004] 按結(jié)石的成分分類，泌尿系結(jié)石包括草酸鈣結(jié)石、尿酸結(jié)石、磷酸鈣結(jié)石、磷酸銨 鎂結(jié)石和胱氨酸結(jié)石，其中，草酸鈣結(jié)石的比例為86. 7%，是泌尿系結(jié)石中發(fā)病率最高的結(jié) 石。
[0005] 草酸鈣結(jié)石成因是由于人體尿液中草酸含量過(guò)高，與鈣離子形成不溶性的草酸鈣 晶體，草酸鈣晶體容易在膀胱、腎臟等器官內(nèi)成核沉積，形成結(jié)石。
[0006] 人體中的草酸來(lái)源包括外源性草酸和內(nèi)源性草酸，外源性草酸是指通過(guò)飲食攝入 吸收的草酸，內(nèi)源性草酸是指人體肝臟自身代謝產(chǎn)生的草酸，草酸鈣結(jié)石患者體內(nèi)的草酸 含量顯著高于正常人群，屬于外源性草酸吸收或內(nèi)源性草酸代謝異常。
[0007] 內(nèi)源性草酸代謝異常的病人多為原發(fā)性高草酸尿癥（Primary Hyperoxaluria， PH)，是一種草酸代謝酶缺失或突變的罕見(jiàn)遺傳病。
[0008] 外源性草酸吸收異常的病人為第二高草酸尿癥（Secondary Hyperoxaluria，SH)， 是由于病人通過(guò)食物攝入過(guò)多的草酸引起的，此類病人在臨床草酸鈣腎結(jié)石患者中占絕大 多數(shù)，也是最常見(jiàn)的草酸鈣結(jié)石病人。
[0009] 外源性草酸吸收異常的病人（第二高草酸尿癥）的成因是多種多樣的：a、飲食習(xí) 慣偏好食用高草酸含量的食物如菠菜，巧克力，花生和濃茶等；b、飲食及作息習(xí)慣不規(guī)律導(dǎo) 致胃腸道功能紊亂從而增加草酸吸收；c、個(gè)人體質(zhì)原因?qū)е缕湮改c道較正常人吸收草酸偏 多；d、工作性質(zhì)相關(guān)或生活中飲水量偏少導(dǎo)致體液內(nèi)草酸濃度偏高；e、某些疾?。ㄈ缒蚨?癥）患者在透析治療過(guò)程中需加入大量的維生素C(草酸前體物），導(dǎo)致體內(nèi)草酸異常偏 高。雖然第二高草酸尿癥病人成病原因各異，但是最終的成石原因都是尿液中的草酸含量 偏高。因此，尿草酸濃度偏高是患草酸鈣結(jié)石的關(guān)鍵性指標(biāo)。通過(guò)檢測(cè)尿液中的草酸含量， 能夠判斷病人是否是罹患草酸鈣結(jié)石的高風(fēng)險(xiǎn)人群。
[0010] 對(duì)于草酸鈣結(jié)石高風(fēng)險(xiǎn)人群及草酸鈣結(jié)石高頻復(fù)發(fā)患者，通過(guò)日常生活中經(jīng)常檢 測(cè)自身尿液中草酸濃度，從而適當(dāng)調(diào)整飲食搭配控制高草酸食物的攝入、調(diào)整作息習(xí)慣降 低胃腸道對(duì)草酸的過(guò)高吸收等，降低尿液中的草酸濃度，從而預(yù)防草酸鈣結(jié)石的形成或復(fù) 發(fā)，避免結(jié)石病的病痛及高昂的治療費(fèi)用。
[0011]日常食物中草酸攝入，是導(dǎo)致尿液草酸濃度偏高的關(guān)鍵性環(huán)節(jié)，如果能及時(shí)了解 飲食中的草酸濃度，有選擇性的健康飲食，就能很大程度的控制并降低外源性草酸的攝入， 從而預(yù)防草酸鈣結(jié)石的形成。然而，食物（尤其是植物）種類和花樣繁多，且其生長(zhǎng)環(huán)境， 氣候及產(chǎn)地，加工過(guò)程及加工條件等諸多因素均可以影響最終成品的草酸含量，因而對(duì)普 通人來(lái)說(shuō)很難知曉并選擇低草酸的食材及食物。進(jìn)食前如果能簡(jiǎn)單方便的針對(duì)草酸進(jìn)行測(cè) 定方可放心使用或控制食用量，進(jìn)而控制高草酸食物的攝入，降低胃腸道對(duì)草酸的吸收，從 而預(yù)防草酸鈣結(jié)石的形成和復(fù)發(fā)。
[0012] 目前市面上尚無(wú)適合家庭用的，操作簡(jiǎn)易，測(cè)試時(shí)間短，且結(jié)果準(zhǔn)確的尿草酸及食 物草酸檢測(cè)產(chǎn)品。僅為收集信息的目的，以下列舉的是目前常用的技術(shù)及其存在的缺陷：
[0013] (1)離子色譜法：收集患者24h尿液用濃鹽酸酸化保存，取0.1 mL尿液，用 0. 3mmol/L的硼酸溶液稀釋，通過(guò)0. 22 μ m的微孔濾膜過(guò)濾除去可能阻塞色譜柱的顆粒物， 上離子色譜儀（DX-80離子色譜儀，Dionex AS14A分離色譜柱），檢測(cè)樣品草酸峰面積計(jì)算 得到草酸濃度，此法對(duì)尿草酸的最小檢測(cè)限為〇. 25 μ M。然而，該方法使用的色譜系統(tǒng)價(jià)格 昂貴，需要專業(yè)技能人員操作，測(cè)試時(shí)間長(zhǎng)，普通個(gè)人或家庭無(wú)法承擔(dān)高昂的設(shè)備費(fèi)用，且 普通人不具備操作技能。
[0014] (2)美國(guó)Trinity公司研發(fā)的草酸測(cè)定試劑盒采用HRP(Horseradish Peroxidase，辣根過(guò)氧化物酶）顯色法，通過(guò)大麥草酸氧化酶將待測(cè)樣品中的草酸催化氧 化為二氧化碳和過(guò)氧化氫，過(guò)氧化氫在HRP作用下與MBTH(3-methyl-2_benzothiazolino ne hydrazone，3_ 甲基-2-苯并噻挫啉酮腙鹽酸鹽）和 DMAB(3_(dimethylamino)benzoic acid，3_二甲基氨基苯甲酸）反應(yīng)生成顯色化合物indamine dye( Π引達(dá)胺染料），由于 Indamine dye在590nm處有特征吸收峰，因此，能夠根據(jù)Indamine dye反應(yīng)前后在590nm 處吸收峰的變化值計(jì)算得到樣品中草酸的含量。該檢測(cè)方法需要專業(yè)檢測(cè)設(shè)備（酶標(biāo)儀或 生化分析儀），價(jià)格相對(duì)昂貴，不合適家庭使用，大麥草酸氧化酶（最優(yōu)酶活PH為3. 2)與辣 根過(guò)氧化物酶（最優(yōu)酶活PH為5. 2)的pH兼容性差，導(dǎo)致靈敏度偏低，且需要對(duì)待測(cè)的樣 品（如尿液）進(jìn)行多次純化，步驟繁瑣且需要一定專業(yè)技能，普通個(gè)人操作不標(biāo)準(zhǔn)會(huì)導(dǎo)致誤 差很大，準(zhǔn)確度低。
[0015] (3)方躍等人用丙酮提取法從香蕉皮中提取草酸氧化酶-丙酮粗提物后，與戊二 醛交聯(lián)并偶合于氧電極，制成香蕉皮-丙酮粉漿草酸組織傳感器，用于尿樣中草酸測(cè)定，該 傳感器的工作曲線線性范圍為10~500 μ mol/L，檢測(cè)限為2. 5 μ mol/L，有效壽命可維持30 天。該傳感器的操作比較復(fù)雜、穩(wěn)定性較差、且有效壽命較短，難以在家庭中使用。
[0016] (4)上海研謹(jǐn)生物科技有限公司用純化的大鼠草酸抗體包被微孔板，制成固相抗 體，向包被單抗的微孔中依次加入大鼠草酸，再與HRP標(biāo)記的草酸抗體結(jié)合，形成抗體-抗 原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過(guò)徹底洗滌后加底物TMB (3, 3'，5, 5'-四甲基聯(lián)苯胺）顯色，TMB在 HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色，用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下 測(cè)定吸光度。由于草酸的分子量較小，與單抗作用后容易脫落，形成的抗體-抗原-酶標(biāo)抗 體復(fù)合物經(jīng)過(guò)徹底洗滌后，有效成分的含量較低，該方法檢測(cè)的靈敏度較低，可靠性較差， 需要專業(yè)設(shè)備和技術(shù)人員，操作難度較大，不適合家庭個(gè)人使用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0017] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷，本發(fā)明的目的在于提供一種用于測(cè)定草酸濃度的試 劑、試劑盒、試紙及其制備方法，使用方便，操作簡(jiǎn)易，測(cè)定時(shí)間短，準(zhǔn)確度較高，抗干擾能力 強(qiáng)，成本低廉，儲(chǔ)存時(shí)間長(zhǎng)，能夠在醫(yī)院、診所及家庭中使用。
[0018] 為達(dá)到以上目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：一種用于測(cè)定草酸濃度的試劑，包括 濃度為10~2000U/L、最適pH值為4. 0~7. 5的草酸氧化酶、濃度為100~2000U/L的辣 根過(guò)氧化物酶和濃度為10~200mmol/L的反應(yīng)劑，反應(yīng)劑為氧化劑或者顯色劑，所述氧化 劑為苯醌或鐵氰化鉀，所述顯色劑為3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙鹽酸鹽或3, 5-二氯-2-羥 基苯磺酸鈉。
[0019] 在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，所述草酸氧化酶的濃度為50~800U/L，辣根過(guò)氧化物 酶的濃度為500~1500U/L，所述反應(yīng)劑