一種快速發(fā)現(xiàn)天然產(chǎn)物中低含量活性成分的新方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及天然產(chǎn)物中化合物提取分離領(lǐng)域，具體涉及一種快速發(fā)現(xiàn)復(fù)雜天然產(chǎn) 物中低含量活性成分的方法。 技術(shù)背景
[0002] 天然藥物主要指天然來源的植物（中草藥）、動(dòng)物、微生物、海洋生物及其他生物 的具有明確治療作用的單一成分或多組分藥物。
[0003] 天然藥物是現(xiàn)代創(chuàng)新藥物發(fā)現(xiàn)的重要來源。許多天然來源的化合物已被發(fā)現(xiàn)具 有多樣且獨(dú)特的生理活性，在此基礎(chǔ)上一大批具有特殊治療作用的藥物被開發(fā)出來。天然 活性物質(zhì)往往具有結(jié)構(gòu)新穎、活性高、不良反應(yīng)少的特點(diǎn)，是制藥工業(yè)中新藥研發(fā)的重要來 源，也是我國(guó)研制具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的創(chuàng)新藥物的主要源泉（參見：蕭偉，陳鳳龍；國(guó)內(nèi)外 天然藥物研究的發(fā)展現(xiàn)狀和趨勢(shì)，中草藥，2009,11 :1681-1687)。
[0004] 大多數(shù)天然產(chǎn)物成分復(fù)雜，含量差異懸殊。生藥中除了含量較高的成分以外，還含 有數(shù)量眾多、含量較低的成分。這些微量成分不僅在天然藥物療效的發(fā)揮中扮演重要角色， 同時(shí)其結(jié)構(gòu)和生物功能的多樣性也為新藥研發(fā)提供了有價(jià)值的信息。許多從天然產(chǎn)物中分 離得到的微量成分具有新穎的化學(xué)結(jié)構(gòu)和顯著的生物學(xué)活性，可作為重要的先導(dǎo)化合物， 有些還被直接開發(fā)成臨床藥物。例如，抗腫瘤藥物紫杉醇和長(zhǎng)春新堿、抗瘧藥物青蒿素等都 是從植物中發(fā)現(xiàn)的微量成分。此外，隨著科研的不斷深入，天然產(chǎn)物中高含量的活性成分已 越來越多地得到發(fā)現(xiàn)和研究，從新的天然資源如海洋生物和研究較少的微量天然產(chǎn)物中尋 找新的活性成分是天然藥物研發(fā)的重要方向之一。
[0005] 然而從復(fù)雜的天然產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)新的微量活性成分卻相當(dāng)耗費(fèi)時(shí)間、人力、物力卻 又低效。傳統(tǒng)的對(duì)大量復(fù)雜天然產(chǎn)物進(jìn)行提取、分離、反復(fù)柱色譜進(jìn)行純化的方法常常導(dǎo) 致生藥中的微量成分在多次柱色譜處理過程中損失，較難獲得足夠量的高純度單體進(jìn)行篩 選。為發(fā)現(xiàn)更多的微量成分，通常采用加大生藥投料量的方式來累積微量成分，但同時(shí)也會(huì) 造成分離工作量的成倍增加和高含量成分的大量干擾，微量活性成分的發(fā)現(xiàn)效率依舊難以 提高。另有報(bào)道將天然產(chǎn)物提取物采用制備型高效液相分離，按時(shí)間分段收集餾分，并將各 餾分經(jīng)脫溶劑處理后用于活性篩選。因天然藥物成分眾多且結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣，按時(shí)間自動(dòng)化 收集的餾分往往是包含2個(gè)以上成分的混合物，經(jīng)初次活性測(cè)定后，還需要對(duì)顯示有活性 的餾分進(jìn)一步分離純化，制備出單體化合物，即需重復(fù)進(jìn)行樣品富集、分離純化、餾分收集、 溶劑去除、樣品干燥、活性測(cè)試和結(jié)構(gòu)鑒定等步驟來確定活性餾分中的活性成分。更重要的 是，餾分中的微量成分很可能因達(dá)不到活性起效的濃度而被漏篩。因此，提高從天然產(chǎn)物中 發(fā)現(xiàn)微量活性化合物的效率，縮短發(fā)現(xiàn)時(shí)間，降低發(fā)現(xiàn)成本，是天然藥物活性成分研究和 開發(fā)亟需解決的問題之一。
[0006] CN103487531A公開了一種適用于復(fù)雜天然產(chǎn)物高通量篩選的化合物庫(kù)高效制備 方法，該方法能夠快速、精確、自動(dòng)化地制備指紋圖譜中各指紋峰對(duì)應(yīng)的餾分，所制備樣品 純度高，餾分不易含有共洗脫成分。但該方法由于未將復(fù)雜天然產(chǎn)物中的高、低含量成分區(qū) 別對(duì)待，在基于全成分色譜指紋圖譜的餾分制備過程中，當(dāng)高含量成分的制備量達(dá)到活性 篩選的起效濃度時(shí)，而低含量成分由于制備量較低，往往尚未達(dá)到起效濃度而難以被發(fā)現(xiàn)。 因此該方法不能有效地解決低含量活性成分的發(fā)現(xiàn)難題。
[0007] 本發(fā)明針對(duì)天然藥物中的微量活性成分，在將全成分劃分為高低含量成分的基礎(chǔ) 上，結(jié)合色譜峰敲除技術(shù)和高純度餾分制備手段，快速、自動(dòng)化、選擇性地富集低含量餾分， 使低含量成分達(dá)到能夠進(jìn)行篩選的有效濃度，從而顯著提高復(fù)雜天然產(chǎn)物中微量活性成分 發(fā)現(xiàn)的靈敏度、精確度及篩選效率，有利于活性成分的快速發(fā)現(xiàn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 針對(duì)天然藥物中成分含量差異懸殊的情況，本發(fā)明建立了一種適合天然藥物中低 含量活性成分快速發(fā)現(xiàn)的方法。
[0009] 本發(fā)明首先建立天然藥物提取物的常規(guī)液相色譜分析方法，建立全成分色譜指紋 圖譜；然后，將提取物中各成分根據(jù)其相對(duì)含量劃分為高含量成分和低含量成分，基于指紋 圖譜采用高分辨色譜峰餾分制備方法建立高含量成分餾分庫(kù)，并對(duì)敲除高含量成分后的流 出液（包含低含量成分）進(jìn)行富集、濃縮，經(jīng)二次高分辨色譜峰餾分制備獲得低含量餾分 庫(kù)；采用串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)器同步獲取高、低含量餾分庫(kù)的質(zhì)譜信息進(jìn)行化合物鑒定；進(jìn)而開 展對(duì)高、低含量餾分的活性測(cè)試和量效關(guān)系考察，實(shí)現(xiàn)對(duì)天然藥物中微量成分的活性評(píng)價(jià)。 [0010] 該方法快速、精確、自動(dòng)化程度高、操作簡(jiǎn)便、成本較低、適用性強(qiáng)，適用于天然產(chǎn) 物中微量活性成分的發(fā)現(xiàn)。
[0011] 本發(fā)明包括以下內(nèi)容：
[0012] -種快速發(fā)現(xiàn)天然產(chǎn)物中低含量活性成分的方法，其特征在于，包括以下步驟：
[0013] (1)以一種天然來源的植物、動(dòng)物、微生物、海洋生物或中藥復(fù)方等為對(duì)象，制備相 應(yīng)的提取物；
[0014] (2)采用常規(guī)液相色譜系統(tǒng)與自動(dòng)組分收集系統(tǒng)聯(lián)用，建立上述分析對(duì)象的全成 分色譜指紋圖譜條件；
[0015] (3)高低含量成分的劃分：采用面積歸一化法，將各活性化合物在樣品制備色譜 圖中顯示的峰面積，分別與各活性化合物在樣品制備色譜圖中顯示的峰面積的總和相比， 得到各活性成分的相對(duì)含量。并將各活性成分的相對(duì)含量按照從低到高的順序排序，選擇 合適的標(biāo)準(zhǔn)將全成分劃分為高含量成分和低含量成分；
[0016] (4)高含量餾分庫(kù)的建立：
[0017] 運(yùn)行步驟（2)中的色譜指紋圖譜條件，通過軟件設(shè)置各指紋峰的起始時(shí)間和結(jié)束 時(shí)間以及收集位置，使組分收集系統(tǒng)的程序根據(jù)上述設(shè)置，自動(dòng)、精確地收集各指紋峰；單 次進(jìn)樣直接收集高含量成分獲得高含量餾分庫(kù)；
[0018] 低含量餾分庫(kù)的建立：
[0019] 敲除高含量成分之后對(duì)低含量成分進(jìn)行富集，樣品經(jīng)回收溶劑后再次進(jìn)樣，自動(dòng)、 精確收集指紋圖譜中的每一個(gè)色譜峰（餾分）；
[0020] (5)采用串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)器同步獲取高、低含量餾分庫(kù)的質(zhì)譜信息進(jìn)行化合物鑒 定；
[0021] (6)對(duì)每個(gè)餾分進(jìn)行脫溶劑處理，以備后續(xù)篩選。
[0022] 本發(fā)明包括以下內(nèi)容：
[0023] (1)以一種天然來源的植物、動(dòng)物、微生物、海洋生物或中藥復(fù)方等為對(duì)象，制備相 應(yīng)的提取物。所述的提取物是采用高、中、低極性或不同酸堿性溶劑分別提取天然來源的研 究對(duì)象所得到的或經(jīng)初步分離得到的混合物。
[0024] (2)采用高效液相色譜進(jìn)行樣品的色譜表征和優(yōu)化，建立該提取物的指紋圖譜。
[0025] 建立全成分指紋圖譜的液相色譜的色譜條件可以是：分離采用的色譜柱內(nèi)徑 < 20mm、粒徑< 5 μπι ;流速為0. 5-10mL/min，分析時(shí)間< 3h ;優(yōu)選的，色譜條件可以是：分 離采用的色譜柱內(nèi)徑彡l〇mm、粒徑彡5 μπι ;流速為1~5mL/min，分析時(shí)間彡2h ;更優(yōu)選的， 色譜條件可以是：分離采用的色譜柱內(nèi)徑彡5mm、粒徑彡5 μπι;流速為1~2mL/min，分析時(shí) 間彡2h。
[0026] (3)高、低含量成分的劃分：具體實(shí)施方法可以根據(jù)高效液相色譜或質(zhì)譜響應(yīng)采 用面積歸一化法、標(biāo)準(zhǔn)曲線法、內(nèi)標(biāo)法以及標(biāo)準(zhǔn)加入法進(jìn)行定量分析。按照測(cè)量參數(shù)可以分 為峰面積法或峰高法分析化合物的含量。將化合物的含量按照從低到高排序，將全成分劃 分為高含量成分和低含量成分；
[0027] (4)高含量成分餾分庫(kù)的制備：運(yùn)行⑵中的指紋圖譜色譜分析條件，通過軟件設(shè) 置高含量目標(biāo)峰的起始時(shí)間和結(jié)束時(shí)間以及收集位置，使組分收集系統(tǒng)的程序根據(jù)上述設(shè) 置，自動(dòng)、精確地收集高含量目標(biāo)峰。可根據(jù)餾分的體積適當(dāng)調(diào)整收集容器的大小。單次進(jìn) 樣收集高含量目標(biāo)成分色譜峰（餾分），對(duì)每個(gè)餾分進(jìn)行脫溶劑處理，獲得高含量成分餾分 庫(kù)。
[0028] (5)低含量成分餾分庫(kù)的制備：重復(fù)數(shù)次（4)，將高含量目標(biāo)峰以外的流出液，即 敲除高含量目標(biāo)峰后的低含量成分的混合液，收集于同一容器。根據(jù)低含量餾分實(shí)際濃度 的需要，可選擇重復(fù)2~5次或更多次，收集的混合液經(jīng)脫溶劑處理后，再次進(jìn)樣，運(yùn)行指 紋圖譜色譜分析條件，對(duì)照全成分色譜圖和富集后的低含量成分色譜圖中每個(gè)色譜峰的出 峰順序，對(duì)所有低含量成分色譜峰進(jìn)行編號(hào)，按照上述餾分收集程序的設(shè)置方法，重新設(shè)置 低含量成分的餾分收集程序，自動(dòng)、精確收集低含量成分指紋圖譜中的每一個(gè)色譜峰（餾 分），對(duì)每個(gè)餾分進(jìn)行脫溶劑處理，獲得經(jīng)過富集的低含量成分餾分庫(kù)。
[0029] (6)對(duì)每個(gè)餾分進(jìn)行脫溶劑處理：可采用氮吹、加熱或真空離心干燥等方式進(jìn)行 快速脫溶劑處理，以備后續(xù)篩選。
[0030] (7)液相色譜-組分收集系統(tǒng)同步聯(lián)接質(zhì)譜檢測(cè)器，液相流出液在線分流后進(jìn)入 質(zhì)譜檢測(cè)器，同時(shí)獲得高、低含量色譜峰各自對(duì)應(yīng)的質(zhì)譜信息，對(duì)收集得到的各餾分進(jìn)行純 度檢測(cè)、結(jié)構(gòu)推測(cè)和成分鑒定。
[0031] (8)制備的高、低含量餾分庫(kù)樣品可用于多種模型的高通量篩選，因各餾分化合物 的量不一致，可設(shè)計(jì)高、中、低三個(gè)給藥濃度進(jìn)行給藥，即將每個(gè)餾分樣品不同倍數(shù)稀釋成 高、中、低三個(gè)濃度分別測(cè)試，根據(jù)活性測(cè)定值并結(jié)合與濃度的關(guān)系來評(píng)判樣品有無活性。
[0032] 本發(fā)明包括以下內(nèi)容：
[0033] (1)以一種天然來源的植物、動(dòng)物、微生物、海洋生物或中藥復(fù)方等為對(duì)象，制備相 應(yīng)的提取物。所述的提取物是采用高、中、低極性或不同酸堿性溶劑分別提取天然來源的研 究對(duì)象所得到的或經(jīng)初步分離得到的混合物。
[0034] (2)采用高效液相色譜進(jìn)行樣品的色譜表征和優(yōu)化，建立該提取物的指紋圖譜。
[0035] 建立全成分指紋圖譜的液相色譜的色譜條件可以是：分離采用的色譜柱內(nèi)徑 < 20mm、粒徑< 5 μπι