;流速為0. 5-10mL/min，分析時(shí)間< 3h ;優(yōu)選的，色譜條件可以是：分 離采用的色譜柱內(nèi)徑彡l〇mm、粒徑彡5 μπι ;流速為1~5mL/min，分析時(shí)間彡2h ;更優(yōu)選的， 色譜條件可以是：分離采用的色譜柱內(nèi)徑彡5mm、粒徑彡5 μπι;流速為1~2mL/min，分析時(shí) 間彡2h。
[0036] (3)高、低含量成分的劃分：具體實(shí)施方法可以根據(jù)高效液相色譜或質(zhì)譜響應(yīng)采 用面積歸一化法、標(biāo)準(zhǔn)曲線法、內(nèi)標(biāo)法以及標(biāo)準(zhǔn)加入法進(jìn)行定量分析。按照測(cè)量參數(shù)可以分 為峰面積法或峰高法分析化合物的含量。將化合物的含量按照從低到高排序，將全成分劃 分為高含量成分和低含量成分；
[0037] (4)高含量成分餾分庫(kù)的制備：運(yùn)行⑵中的指紋圖譜色譜分析條件，通過(guò)軟件設(shè) 置高含量目標(biāo)峰的起始時(shí)間和結(jié)束時(shí)間以及收集位置，使組分收集系統(tǒng)的程序根據(jù)上述設(shè) 置，自動(dòng)、精確地收集高含量目標(biāo)峰。可根據(jù)餾分的體積適當(dāng)調(diào)整收集容器的大小。單次進(jìn) 樣收集高含量目標(biāo)成分色譜峰（餾分），對(duì)每個(gè)餾分進(jìn)行脫溶劑處理，獲得高含量成分餾分 庫(kù)。
[0038] (5)低含量成分餾分庫(kù)的制備：重復(fù)數(shù)次（4)，將高含量目標(biāo)峰以外的流出液，即 敲除高含量目標(biāo)峰后的低含量成分的混合液，收集于同一容器。根據(jù)低含量餾分實(shí)際濃度 的需要，可選擇重復(fù)2~5次或更多次，收集的混合液經(jīng)脫溶劑處理后，再次進(jìn)樣，可以選擇 同上述的指紋圖譜色譜分析條件，也可以通過(guò)調(diào)整洗脫時(shí)間、壓力、溫度等，重新設(shè)置指紋 圖譜色譜分析條件，從而提高高低含量成分色譜峰的洗脫效率。對(duì)照全成分色譜圖和富集 后的低含量成分色譜圖中每個(gè)色譜峰的出峰順序，對(duì)所有低含量成分色譜峰進(jìn)行編號(hào)，按 照上述餾分收集程序的設(shè)置方法，重新設(shè)置低含量成分的餾分收集程序，自動(dòng)、精確收集低 含量成分指紋圖譜中的每一個(gè)色譜峰（餾分），對(duì)每個(gè)餾分進(jìn)行脫溶劑處理，獲得經(jīng)過(guò)富集 的低含量成分餾分庫(kù)。
[0039] (6)對(duì)每個(gè)餾分進(jìn)行脫溶劑處理：可采用氮吹、加熱或真空離心干燥等方式進(jìn)行 快速脫溶劑處理，以備后續(xù)篩選。
[0040] (7)液相色譜-組分收集系統(tǒng)同步聯(lián)接質(zhì)譜檢測(cè)器，液相流出液在線分流后進(jìn)入 質(zhì)譜檢測(cè)器，同時(shí)獲得高、低含量色譜峰各自對(duì)應(yīng)的質(zhì)譜信息，對(duì)收集得到的各餾分進(jìn)行純 度檢測(cè)、結(jié)構(gòu)推測(cè)和成分鑒定。
[0041] (8)制備的高、低含量餾分庫(kù)樣品可用于多種模型的高通量篩選，因各餾分化合物 的量不一致，可設(shè)計(jì)高、中、低三個(gè)給藥濃度進(jìn)行給藥，即將每個(gè)餾分樣品不同倍數(shù)稀釋成 高、中、低三個(gè)濃度分別測(cè)試，根據(jù)活性測(cè)定值并結(jié)合與濃度的關(guān)系來(lái)評(píng)判樣品有無(wú)活性。 [0042] 相對(duì)于傳統(tǒng)方法，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：
[0043] 1、本發(fā)明區(qū)別對(duì)待復(fù)雜天然產(chǎn)物中的高、低含量成分，能夠有效避免篩選過(guò)程中 對(duì)微量活性成分的遺漏，提高從復(fù)雜天然產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)微量活性成分的效率。
[0044] 天然產(chǎn)物成分復(fù)雜，且含量差異較大。很多時(shí)候，微量成分由于達(dá)不到起效濃度而 被忽略，所以將高含量成分和低含量成分按同一個(gè)水平進(jìn)行活性篩選，顯然是不合適的。本 發(fā)明首先將全成分劃分為高含量成分和低含量成分，結(jié)合色譜峰敲除技術(shù)和餾分富集手段 實(shí)現(xiàn)對(duì)含量差異懸殊樣品中微量成分的化合物庫(kù)構(gòu)建，使低含量成分得以凸顯，達(dá)到能夠 進(jìn)行篩選的有效濃度，降低在活性篩選過(guò)程中高含量成分對(duì)微量成分的干擾，顯著提高了 從復(fù)雜天然產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)微量活性成分的靈敏度、準(zhǔn)確度及篩選效率，對(duì)微量成分的發(fā)現(xiàn)、研 究、開發(fā)更具有針對(duì)性和普適性。
[0045] 2、本發(fā)明的低含量成分制備方法具有快速、成本低、操作簡(jiǎn)便、自動(dòng)化程度高等優(yōu) 點(diǎn)。
[0046] 本方法通過(guò)采用液相色譜-組分收集系統(tǒng)分別對(duì)高、低含量餾分進(jìn)行高效自動(dòng) 化、精確收集，且餾分的制備與餾分的質(zhì)譜分析同步銜接；高含量成分的敲除、低含量成分 的富集和餾分庫(kù)的構(gòu)建整個(gè)過(guò)程，在軟件控制下24小時(shí)內(nèi)即可獲得高通量篩選所需的樣 品量，較傳統(tǒng)的低含量成分樣品的分離制備過(guò)程大大縮短時(shí)間、人力和物力。
【附圖說(shuō)明】
[0047] 圖1 :不同色譜條件下的全成分色譜指紋圖譜
[0048] 圖2 :丹參酮高、低含量成分劃分示意圖
[0049] 圖3 :丹參酮高含量成分敲除前、后的色譜圖
[0050] 圖4 :丹參酮低含量餾分庫(kù)色譜圖以及活性篩選結(jié)果圖
[0051] 圖3由（A)、（B)、（C)三部分組成：㈧丹參酮全成分色譜圖；(B)丹參酮類敲除高 含量成分后合并高含量餾分的分析色譜圖；(C)丹參酮類敲除高含量成分后富集低含量成 分的分析色譜圖。
[0052] 圖4由（A)、⑶兩部分組成：(A) 62個(gè)餾分28Inm下色譜圖；（B) 62個(gè)餾分三個(gè)濃 度梯度的中濃度誘導(dǎo)熒光素酶的活性圖。
【具體實(shí)施方式】
[0053] 以下將通過(guò)具體的實(shí)施例來(lái)描述本發(fā)明，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。下述 實(shí)施例為本發(fā)明具有代表性的實(shí)施方案的舉例說(shuō)明，僅僅是示例性的說(shuō)明，但本發(fā)明的實(shí) 施方式并不受下述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改 變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0054] 實(shí)施例1 :丹參提取物中激活Nrf2-ARE通路的微量活性成分快速篩選
[0055] 1、儀器和材料
[0056] 高效液相系統(tǒng)為Agilent 1100HPLC system(Agilent，德國(guó)）；四級(jí)桿質(zhì)譜檢測(cè) 器（Agilent，德國(guó)），具電噴霧離子源（ESI)、雙高壓栗、脫氣機(jī)、盤式自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱和 DAD檢測(cè)器；Sovall Evolution RC型高速冷凍離心機(jī)（KENDR0,美國(guó)）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（BUchi， 瑞士）；LABC0NC0冷凍干燥儀；BP211D十萬(wàn)分之一電子天平（Sartorius，德國(guó)）；溶劑蒸發(fā) 工作站（Gene Vac EZ-2) 〇
[0057] 超凈臺(tái)（美國(guó) Thermo 公司，Thermo Scientific 1300A2 型）；C02培養(yǎng)箱（美國(guó) Thermo公司，series 2 Water Jacket);立式超低溫保存箱（海爾公司，DW-86L386);離心 機(jī)（美國(guó)Thermo公司，F(xiàn)rescol7);酶標(biāo)儀（BioTek公司，Synergy 2型）；電熱恒溫水浴鍋 (國(guó)華電器有限公司，HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋）；電子天平（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公 司）；液氮罐（國(guó)產(chǎn)）；多用途旋禍混合器（美國(guó)Scientific Industries);細(xì)胞培養(yǎng)耗材、 微量移液器購(gòu)于美國(guó)Thermo公司。
[0058] 藥材：丹參（陜西商洛），經(jīng)鑒定為唇形科植物丹參Salvia miltiorrhiza Bge.的 干燥根及根莖。
[0059] 試劑：色譜純乙腈（Merck，德國(guó)），色譜純甲酸（98 % ;Merck，德國(guó)），超純水 (Millipore，美國(guó)），分析純甲醇和乙醇（漢邦科技公司，南京）。
[0060] 293T/17細(xì)胞（源于美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)）；感受態(tài)細(xì)胞DH5 α ;氨芐；SDS ; Tris-base ;Glycine ;Yeast Extract ;Tryptone ;瓊脂粉；氯化鈉（分析純）；二甲基亞砜 (DMSO) ;t_BHQ;Lipofectamine 3000、Opti-MEM(Invitrogen);高純度質(zhì)粒小提中量試劑 盒（天根生化科技有限責(zé)任公司）；Glo Lysis Buffer、Steady-Glo luciferase Assay system(Promega公司）；焚光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒；β -半乳糖苷酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑 盒。
[0061] 2、實(shí)驗(yàn)部分
[0062] 2. 1.丹參藥材提取物的制備
[0063] 丹參藥材粉碎，過(guò)40目篩，稱取150g藥材粉末，以10倍量乙酸乙酯（1500ml)超 聲提取2h，冷卻，過(guò)濾。合并濾液減壓回收，真空冷凍干燥，制備得到提取物凍干粉，保存于 密閉的干燥器中。
[0064] 2. 2.高、低含量餾分庫(kù)的制備
[0065] HPLC-UV條件：分析型色譜柱：Agilent ZorBax SB-C18 柱（4. 6mmX 250mm，5 μ m)。
[0066] 半制備型色譜柱：Agilent Zorbax SB-C18 柱（9. 4mmX 250mm，5 μ m);
[0067] 流動(dòng)相：Α相為0. 02%甲酸-水，B相為乙腈；
[0068] 梯度洗脫程序：
[0069] 0_5min，25%B;
[0070] 5-25min, 25-45% B ；
[0071] 25-40min,45-50% B ；
[0072] 40-43min, 50-55% B ；
[0073] 43-48min,55% B ：
[0074] 48-65min, 55-65% B ；
[0075] 65-70min, 65-70% B ；
[0076] 70-90min, 70-100% B ；
[0077] 90-100min, 100% B〇
[0078] 流速分別為：0· 5mL/min 和 2mL/min。
[0079] 進(jìn)樣量分別為10 μ L和20 μ L，檢測(cè)波長(zhǎng)28lnm。
[0080] 收集的容器包括2mL、8mL和20mL等不同規(guī)格試管。
[0081] 本實(shí)驗(yàn)收集高含量成分色譜峰的6個(gè)餾分，
[0082] 本實(shí)驗(yàn)收集低含量成分色譜峰的62個(gè)餾分，用溶劑蒸發(fā)工作站進(jìn)行離心干燥處 理6-8h。干燥后的樣品即可用于活性測(cè)試。
[0083] 將全色譜圖中各色譜峰對(duì)應(yīng)成分在樣品色譜圖