in, 70-80% B ；
[0129] 93-102min, 80-90% B ；
[0130] 102-110min,90-100% B ；
[0131] 檢測波長28Inm ;
[0132] (3)運行步驟（2)中的色譜指紋圖譜分析條件，進樣系統(tǒng)和收集系統(tǒng)均由軟件控 制，通過軟件設置各指紋峰的起始時間和結束時間以及收集位置，編輯組分收集系統(tǒng)的程 序，自動、精確收集各指紋峰；
[0133] (4)用容器共收集到75個不同色譜峰餾分，針對每個指紋峰，分別運行1~2次餾 分收集程序；
[0134] (5)所有餾分將由程序按編號收集于特定的位置中，使收集完畢后用真空離心干 燥濃縮裝置進行低溫離心干燥處理，離心時間為3h ;
[0135] (6)丹參乙酸乙酯提取物所得的75個微量樣品干燥后構成了一個供高通量篩選 的化合物庫。該化合物庫能用于不同系統(tǒng)的活性測試，例如：細胞、細胞器、蛋白質水平的快 速活性篩選。
[0136] 3. 3. 3丹參酮類高低含量餾分庫的制備方法與CN103487531A的丹參高通量篩選 的化合物庫的制備方法的區(qū)別
[0137] 流動相的組成：本方法流動相中的水相采用0. 02%甲酸-水，CN103487531A采用 0. 1 %甲酸-水；兩者的甲酸含量不同。
[0138] 洗脫程序：從全成分洗脫而言，本方法的洗脫程序較CN103487531A的程序縮短了 分析時間，但同樣達到了較好的分離效果。
[0139] 從洗脫的目的而言，本發(fā)明的洗脫程序得到了丹參酮類高低含量餾分庫，而 CN103487531A只能得到丹參酮類全成分餾分庫。
[0140] 3. 4.餾分庫的活性篩選
[0141] 依照上述餾分庫的建立方法共收集高含量餾分6個，低含量餾分62個。6個高含 量餾分的活性篩選數據以及在丹參藥材中含量列于表1。分析發(fā)現(xiàn)高含量成分與低含量成 分相比在含量上有明顯差別，單次進樣收集的高含量餾分均可在不同程度激活Nrf2/ARE 通路。對低含量餾分庫中全部62個餾分分別進行高、中、低三個濃度的活性初篩，選擇中濃 度活性結果作圖，如圖4 (B)所示。在62個低含量餾分中，誘導熒光素酶的倍數超過2. 5倍 的有33個餾分，說明這些餾分對Nrf2/ARE通路有一定的激活作用，它們在丹參藥材中的含 量和不同濃度樣品的誘導熒光素酶活性見表2。
[0142] 本實驗共篩選出33個低含量活性餾分，這些活性餾分在丹參藥材中的含量均在 3%。以下。其中含量小于等于1%。的有24個；含量小于0. 5%。的有17個；含量小于0. 1%。的 有3個。發(fā)現(xiàn)的活性成分中，除丹參二醇B、丹參酮IIB等12個化合物有相關活性報道外， 另外21個化合物均沒有該活性的報道。
[0143] 中藥成分復雜，含量懸殊。在篩選中，某些微量成分因達不到起效濃度而被漏篩。 本實驗結果顯示，本中藥復雜體系的微量活性成分的發(fā)現(xiàn)方法，可以從天然產物中篩選得 到更多微量的活性成分。結合高、中、低三個濃度的活性篩選方式，可以提高篩選的準確性， 減少假陽性的篩選結果。
[0144] 表1. 6個高含量餾分在丹參藥材中的含量（％。）及熒光素酶活性
[0145] 高含量餾分 焚光酶活性倍數 含量 Low Med High (%〇) a 1.51 2.53 0.1 8.16 b 3.81 7.47 3.67 4.57 c 1.07 2.97 3.25 27.7 d 2.75 1.82 0.004 18.4 e 5.63 3.77 1.65 19.2 f 2.43 3.58 4.18 3.17
[0146] 表2. 33個微量活性餾分在丹參藥材中的含量（％。）以及熒光素酶活性
[0147] 峰號 熒光酶活性倍數 含量 Low Med High (%〇) 4 3.75 3.74 2.71 1.4 5 1.6 3.06 3.58 0.14 10 2.16 3.01 3.99 0.42 11 2.15 3.44 3.06 0.92 13 2.57 8.38 10.59 0.29 14 8.1 11.71 11.14 0.44 15 5.97 12.33 10.78 0.92 16 4.73 6.23 7.28 0.21 18 4.01 7.58 4.75 0.11
[0148] 19 3.4 3.49 5.65 1.1 20 4.63 8.7 9.14 <0.10 21 4.2 10.35 6.53 0.89 22 14.56 10.91 4.76 1.69 23 9.98 12.43 14.85 0.33 24 6.95 11.48 14.94 0.42 25 5.85 6.86 8.48 0.27 26 5.72 5.72 0.45 0.85 27 3.71 4.34 4.17 0.57 28 4.49 6.38 3.08 0.78 29 6.47 3.59 0.07 2.05 31 2.59 4.24 3.54 2.1 32 0.884 2.82 3.38 0.81 34 1.5 2.58 0.67 2.5 36 2.89 3.85 1.1 0.37 38 1.87 6.45 4.8 1·〇 41 0.94 3.56 4.07 <0.10 42 3.15 3.42 0.69 <0_10 43 2.1 4.89 0.92 1.82 50 3.15 5.03 0.52 0.22 51 1.63 3.09 2.26 0.98 52 2.56 4.92 3.41 0.25 53 2.15 3.12 1.58 0.36 54 2.17 2.67 2.16 0.34。
【主權項】
1. 一種快速發(fā)現(xiàn)天然產物中低含量活性成分的方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 以一種天然來源的植物、動物、微生物、海洋生物或中藥復方為對象，制備相應的提 取物； (2) 采用常規(guī)液相色譜系統(tǒng)與自動組分收集系統(tǒng)聯(lián)用，建立上述分析對象的全成分色 譜指紋圖譜條件； (3) 高低含量的劃分：采用面積歸一化法，將各活性化合物在樣品制備色譜圖中顯示 的峰面積，分別與各活性化合物在樣品制備色譜圖中顯示的峰面積的總和相比，得到各活 性成分的相對含量。并將各活性成分的相對含量按照從低到高的順序排序，選擇合適的標 準將全成分劃分為高含量成分和低含量成分； (4) 高含量餾分庫的建立： 運行步驟（2)中的色譜指紋圖譜條件，通過軟件設置各指紋峰的起始時間和結束時間 以及收集位置，使組分收集系統(tǒng)的程序根據上述設置，自動、精確地收集各指紋峰；單次進 樣直接收集高含量成分獲得高含量餾分庫； 低含量餾分庫的建立： 敲除高含量成分之后對低含量成分進行富集，樣品經回收溶劑后再次進樣，自動、精確 收集指紋圖譜中的每一個色譜峰，即餾分； (5) 采用串聯(lián)質譜檢測器同步獲取高、低含量餾分庫的質譜信息進行化合物鑒定； (6) 對每個餾分進行脫溶劑處理，以備后續(xù)篩選。2. 如權利要求1所述的一種快速發(fā)現(xiàn)天然產物中低含量活性成分的方法，其特征在 于，步驟（1)中的天然產物是天然來源的植物、動物、微生物、海洋生物、中藥復方的提取物 或由其活性導向分離得到的提取物部位。3. 如權利要求1所述的一種快速發(fā)現(xiàn)天然產物中低含量活性成分的方法，其特征在 于，步驟（2)中的常規(guī)半制備型液相色譜系統(tǒng)的色譜條件如下：分離采用的色譜柱內徑 < 10mm、粒徑< 5μm;流速為2mL/min，分析時間< 2h。4. 如權利要求1所述的一種快速發(fā)現(xiàn)天然產物中低含量活性成分的方法，其特征在 于，步驟（3)中將高低含量成分區(qū)別對待，能夠避免由于天然產物成分復雜、含量懸殊造成 的活性篩選過程中對微量成分的漏篩，減少在制備過程中高含量成分對微量成分的干擾。5. 如權利要求1所述的一種快速發(fā)現(xiàn)天然產物中低含量活性成分的方法，其特征在 于，步驟（4)中應用高分辨色譜峰餾分庫制備方法將高低含量成分分別建庫，高含量成分 單次進樣得到的樣品即可滿足活性篩選的要求；低含量成分經富集過程，使之成為"高含量 成分"，進而滿足活性篩選的要求。6. 如權利要求1所述的一種快速發(fā)現(xiàn)天然產物中低含量活性成分的方法，其特征在 于，步驟（4)中的供篩選的高低含量化合物庫適用于細胞、細胞器、蛋白質水平的快速活性 篩選；其中化合物庫含有幾十個至上百個微量樣品。7. 如權利要求1所述的一種快速發(fā)現(xiàn)天然產物中低含量活性成分的方法，其特征在 于，步驟（5)中常規(guī)液相色譜-組分收集系統(tǒng)同步聯(lián)接質譜檢測器，同時將液相流出液在線 按比例分流進入質譜檢測器，對收集得到的各餾分進行純度檢測、結構推測和成分鑒定。8. 如權利要求1所述的一種快速發(fā)現(xiàn)天然產物中低含量活性成分的方法，其特征在 于，步驟(6)中可采用氮吹、加熱或真空離心干燥等方式進行快速脫溶劑處理，以備后續(xù)篩
【專利摘要】本發(fā)明涉及天然藥物領域，具體涉及一種快速發(fā)現(xiàn)天然產物中低含量活性成分的方法。該方法通過相對定量將天然藥物的全成分劃分為高含量成分和低含量成分，采用高分辨色譜峰餾分制備方法直接建立高含量餾分庫，并獲得相應質譜信息。在敲除這些高含量成分之后對低含量成分進行富集，溶劑濃縮并二次分離之后獲得低含量餾分庫，同時獲得低含量成分質譜信息。在此基礎上，分別對高、低含量餾分進行活性篩選。該方法具有快速、精確、自動化程度高、操作簡便、成本較低、適用性強等優(yōu)點，適用于天然產物中低含量活性成分的發(fā)現(xiàn)。
【IPC分類】G01N30/34, G01N30/02
【公開號】CN105259262
【申請?zhí)枴緾N201510654715
【發(fā)明人】陳君, 李雪巖, 楊琳, 李萍, 張柳
【申請人】中國藥科大學
【公開日】2016年1月20日
【申請日】2015年10月9日