中顯示的峰面積，代入丹參酮IIA 的標準曲線，計算各成分在丹參藥材中的含量。丹參酮IIA標準曲線的計算采用最小二乘 法，進樣8個梯度濃度，每個濃度重復進樣3次，以濃度為橫坐標，以峰面積響應值為縱坐 標，得到分析物濃度和峰面積之間的線性關(guān)系。
[0084] 利用面積歸一化法，將各活性化合物在樣品制備色譜圖中顯示的峰面積，分別與 各活性化合物在樣品制備色譜圖中顯示的峰面積的總和相比，計算各活性化合物的相對含 量。并將各活性化合物的相對含量按照從低到高的順序排序，劃分高低含量成分，確定高含 量目標成分色譜峰。
[0085]自動組分收集器包括自動進樣系統(tǒng)、自動餾分收集系統(tǒng)和LEAP Shell-PAL軟件操 作系統(tǒng)三個部分。
[0086] 根據(jù)色譜指紋圖譜中各色譜峰的起始時間和結(jié)束時間，編寫控制程序軟件，將液 相色譜與自動微量組分收集系統(tǒng)聯(lián)用，根據(jù)丹參酮類高、低含量成分劃分結(jié)果將各高含量 目標成分與其余的餾分分別收集。
[0087] 一次進樣可收集高含量丹參酮成分色譜峰（餾分）；
[0088] 重復三次進樣，收集高含量目標峰以外的流出液，得到富集的低含量丹參酮成分 的混合液。該樣品經(jīng)旋蒸、真空離心干燥快速回收溶劑后再次進樣，運行上述指紋圖譜色譜 分析條件，對照全成分色譜圖和富集后的低含量成分色譜圖中每個色譜峰的出峰順序，對 所有低含量成分色譜峰進行編號，按照同上述餾分收集程序的設置方法，重新設置低含量 成分的餾分收集程序，自動、精確收集指紋圖譜中的每一個色譜峰（餾分），得到丹參酮低 含量餾分。
[0089] 收集的各餾分經(jīng)脫溶劑處理，供后續(xù)篩選使用。
[0090] 餾分制備的同時，液相流出液分流到質(zhì)譜檢測器，同步獲取各餾分的質(zhì)譜、分子量 等信息，建立各餾分對應的質(zhì)譜信息庫。
[0091] 2.3.活性篩選即熒光素酶報告基因檢測
[0092] 293T細胞瞬時轉(zhuǎn)染含有ARE啟動子序列的熒光素酶報告基因，以Iip 3000作為 轉(zhuǎn)染試劑，鋪板后24h轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染24h后用無血清培養(yǎng)基給藥，用含1 % DMSO的ImL無血清 的DMEM培養(yǎng)基溶解色譜峰餾分樣品，作為高濃度樣品；從高濃度樣品中取出250 yL，加入 250 μ L無血清DMEM培養(yǎng)基（含1 % DMS0)，混勻，作為中濃度樣品；再從高濃度樣品吸取 100 μ L，加入400 μ L無血清DMEM培養(yǎng)基（含1 % DMS0)中，混勻，作為低濃度樣品。配藥結(jié) 束后，每孔加入100 μ L，設置三個復孔，18h后進行檢測。用細胞裂解液搖床裂解15min，采 用熒光素酶活性測試系統(tǒng)進行檢測。
[0093] 2. 4.質(zhì)譜條件
[0094] T0F/MS條件：電噴霧離子源參數(shù)：干燥氣流速（N2Drying gas flow-rate): 10.0 L/min;干燥氣溫度（Drying gas temperature) :33〇°C ;霧化氣壓力（Nebulizer): 241kPa(35psig);毛細管電壓（Capillary voltage) :3000V;裂解電壓（Fragmentor): 120 ~420V ；skimmer voltage,60V ；octapole DC 1，37V ;octapole radio frequency, 250V。數(shù)據(jù)采集和分析分別由Agilent MassHunter Acquisition軟件（Agilent，美國）和 Applied Biosystems/MDS-Sciex Analyst QS 軟件（Frankfurt，德國）完成。
[0095] 3、實驗結(jié)果
[0096] 3. 1.丹參藥材提取物的色譜表征
[0097] 丹參藥材提取物的色譜條件優(yōu)化：采用柱長250mm的常規(guī)分析型色譜柱進行分 析，實驗采用梯度程序洗脫，并對洗脫程序、洗脫時間、流動相的PH值等條件進行優(yōu)化，確 定合適的色譜條件（圖1A)。將上述分析條件經(jīng)方法轉(zhuǎn)化后，應用于直徑9. 4mm的半制備型 色譜柱，獲得基本一致的分離效果，各色譜峰基本達到基線分離（圖1B)。采用直徑9. 4_ 的半制備型色譜柱比直徑4. 6mm的分析型色譜柱上樣量可提高10倍以上，一次性收集的高 含量餾分樣品足以用于細胞水平的活性篩選。
[0098] 3. 2.丹參提取物高低含量的劃分
[0099] 經(jīng)液質(zhì)分析，丹參脂溶性提取物成分復雜，含有的丹參酮類成分數(shù)量眾多。因丹參 酮類成分的結(jié)構(gòu)相似，分子量范圍在280Da-31f5Da，分子量大小比較接近，本實驗以丹參酮 II A為對照品，采用"一測多評"的方法計算測定各成分在丹參藥材中的含量。結(jié)果顯示分 析物濃度和峰面積之間有良好的線性關(guān)系，標準曲線的相關(guān)系數(shù)r 2大于0. 999,丹參酮II A的標準曲線方程為y = 59115X+9. 3087。
[0100] 利用面積歸一化法計算各化合物相對含量，并將化合物的相對含量按照從低到 高排序，以相對含量（％)為縱坐標，作出下圖（圖2)。結(jié)合丹參提取物全成分液相分析 色譜圖和各化合物相對含量的數(shù)據(jù)分析，其中6個色譜峰的相對含量和其他色譜峰的相對 含量相比有比較明顯的差別，這6個色譜峰的相對含量依次為：2. 62%、3. 76%、6. 69%、 15. 05%、15. 70%、22. 61%，這6個色譜峰的相對含量之和高達66% ;而其余色譜峰的相對 含量均小于2. 5%，它們相對含量的總和只占總含量的34%。于是本實驗中我們以2. 5%作 為劃分的標準，將相對含量大于2. 5%的6個峰所對應的的成分歸為高含量成分，其余峰所 對應的成分歸為低含量成分。
[0101] 3. 3.丹參酮類高、低含量餾分庫的建立
[0102] 3. 3. 1基于指紋圖譜采用高分辨色譜峰餾分制備方法，單次進樣，直接制備得到含 有6個高含量色譜峰餾分的高含量成分餾分庫，并對敲除高含量成分后的流出液（包含低 含量成分）進行三次富集、濃縮，經(jīng)二次高分辨色譜峰餾分制備獲得含有62個低含量色譜 峰餾分的低含量餾分庫。
[0103] 高含量成分餾分庫的制備方法：
[0104] 采用半制備型色譜柱，運行2. 2中的HPLC-UV條件，按照3. 2所述高低含量成分劃 分結(jié)果，根據(jù)色譜指紋圖譜中6個高含量色譜峰的起始時間和結(jié)束時間，編寫控制程序軟 件，將液相色譜與自動微量組分收集系統(tǒng)聯(lián)用，最終本實驗收集高含量成分色譜峰共6個 餾分；
[0105] 低含量成分餾分庫的制備方法：
[0106] 由于低含量成分在液相色譜中的響應較低，想要一次性制備足夠的低含量成分達 到進行后續(xù)篩選的要求比較困難。所以結(jié)合高含量成分敲除技術(shù)和低含量成分富集手段進 行低含量成分餾分庫的制備。
[0107] 采用半制備型色譜柱，運行2. 2中的HPLC-UV條件，重復上述高含量成分餾分庫的 制備方法，重復三次進樣，將6個高含量目標峰以外的流出液收集子同一容器，得到富集的 低含量丹參酮成分的混合液，該過程即實現(xiàn)高含量成分的敲除。分別取少量敲除前后的樣 品進行液相分析，分析色譜圖如圖3所示。
[0108] 丹參提取物全成分色譜分析圖如圖3A所示，圖中星號標識的為6個高含量成分；6 個單次進樣收集的高含量目標峰餾分，將其混合后所得樣品的色譜分析圖如圖3B所示；敲 除高含量目標峰后富集的低含量餾分，其富集樣品的色譜分析圖如圖3C所示；我們發(fā)現(xiàn)敲 除6個高含量成分后低含量成分的色譜峰得到凸顯。
[0109] 富集的低含量丹參酮成分的混合液經(jīng)旋蒸、真空離心干燥快速回收溶劑，復溶后 再次進樣，運行上述指紋圖譜色譜分析條件，并對照全成分色譜圖中低含量成分的前后出 峰順序，對富集后的所有低含量成分色譜峰進行編號，如圖4 (A)。按照同上述餾分收集程序 的設置方法，重新設置低含量成分的餾分收集程序，自動、精確收集指紋圖譜中的每一個色 譜峰（餾分），得到丹參酮低含量餾分。最終本實驗收集低含量成分色譜峰共62個餾分。
[0110] 3. 3. 2 CN103487531A的丹參高通量篩選的化合物庫的制備
[0111] 其中，申請人以該方法進行了丹參高通量篩選的化合物庫的制備，其具體制備方 法包括以下步驟：
[0112] (1)粉碎丹參，用乙酸乙酯提取丹參，提取液低溫冷凍干燥，制得丹參乙酸乙酯提 取物；
[0113] (2)采用常規(guī)分析型液相色譜系統(tǒng)與自動組分收集系統(tǒng)聯(lián)用，建立丹參乙酸乙酯 提取物的全成分色譜指紋圖譜分析方法；
[0114] 高效液相色譜條件：
[0115] 半制備型色譜柱：Agilent ZorBax SB_C18column (9. 4mmX 250mm，5 μ m)
[0116] 流速：2ml/min，進樣量為20 μ I ;或分析型色譜柱：Agilent ZorBax SB-C18柱 (4. 6mmX 250mm，5 μ m)，流速：0· 5ml/min，進樣量為 2 μ 1 ;
[0117] 柱溫：30°(：;流動相4相為0.1%甲酸水，8相為乙腈；
[0118] 梯度洗脫程序：
[0119] O-IOmin, 7-17% B ；
[0120] 10-12min, 17-20% B ；
[0121] 12-14min,20% B ；
[0122] 14-18min,20-21% B ；
[0123] 18-34min,21% B ；
[0124] 34-40min, 21-29% B ；
[0125] 40-57min, 29-35% B ；
[0126] 57-67min, 35-65% B ；
[0127] 67-87min, 65-70% B ；
[0128] 87-93m